豬基因組中拷貝數(shù)變異分析及多聚腺苷酸化位點的發(fā)掘.pdf

1、1.利用基因組重測序數(shù)據(jù)分析中外豬品種馴化過程中的拷貝數(shù)變異
　　在野豬到家豬的馴化和進一步形成品種的過程中，遺傳、變異和選擇在不同程度上，對品種的形成以及品種差異的產生起著一定的作用。通過研究家豬與野豬及家豬不同品種之間基因組序列的差異，可以發(fā)現(xiàn)基因組上的變異。拷貝數(shù)變異(copynumber variation，CNV)是指與生物正常的基因序列相比，基因組中所發(fā)生的長度范圍介于1Kb至數(shù)Mb的變異，其形式包括重復、缺失及衍生出

2、的復雜染色體微結構變異。本研究利用豬基因組重測序數(shù)據(jù)，對中外家豬13個品種共49個個體進行CNV分析，并分析拷貝數(shù)變異區(qū)域(CNVR)內相關基因的功能。同時，通過比較中外豬品種在馴化過程中產生的CNV，研究中外豬品種在馴化過程中受到選擇的CNV及其相關基因，從而發(fā)現(xiàn)中外豬品種表型差異的遺傳基礎。為進一步解析豬基因組變異及豬品種改良奠定基礎。主要結果如下:
　　1.1利用生物信息學方法分析家豬馴化過程中的CNV。以本實驗室通城豬基因

3、組個體重測序數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)庫下載的不同豬品種和野豬共49個個體重測序數(shù)據(jù)為材料，利用CNVseq和CNVnator軟件分別進行CNV掃描。發(fā)現(xiàn)，從野豬到家豬馴化過程中產生的CNVRs共有3131個，其中拷貝數(shù)增加的區(qū)域有745個、減少的區(qū)域2364個，增加和減少都存在的區(qū)域有22個;根據(jù)CNVR在基因組上的位置，繪制出豬全基因組CNVs圖譜。
　　1.2利用實時熒光定量PCR方法驗證CNVRs。利用實時熒光定量PCR方法對隨機選取

4、的28個區(qū)域進行拷貝數(shù)的驗證，結果24個CNVRs的拷貝數(shù)與預測CNVRs內拷貝數(shù)的增加或減少相符合，驗證符合率為86％。
　　1.3 CNV的分布特征分析。對3131個CNVRs及上下游10Kb區(qū)域中的重復元件（SINE、LINE和LTR等）的數(shù)量及分布密度進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現(xiàn)在CNVRs及上下游10Kb的區(qū)域中，不同重復元件的分布密度均顯著高于基因組中的平均水平，表明CNV常分布在基因組中重復元件附近，重復元件對CNV發(fā)生有

5、重要影響。
　　1.4家豬馴化過程中CNVR相關基因的功能分析。利用BioMart工具，在家豬馴化過程中產生的3131個CNVRs中發(fā)現(xiàn)1266個編碼蛋白的基因，利用DAVID工具對基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與細胞粘附、GTP酶活性、細胞連接、免疫反應、嗅覺和MAPK通路等。
　　1.5中外家豬在馴化過程中產生的差異CNVR及相關基因功能分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，中國家豬中存在2278個CNVRs，歐洲家豬中存在17

6、06個CNVRs。分別特異存在于中外家豬中的CNVRs有129個和147個，分別對CNVRs內相關基因進行功能富集分析，結果顯示，中國家豬馴化過程中產生的特異CNVRs內相關基因的功能富集在免疫反應及生產性狀上;而歐洲家豬馴化過程中產生的特異CNVRs內相關基因的功能富集在肌肉發(fā)育過程。
　　2.利用轉錄組數(shù)據(jù)分析豬基因組多聚腺苷酸化位點
　　多聚腺苷酸化是RNA轉錄后修飾的一個重要過程，在mRNA的轉運及成熟mRNA的翻譯

7、過程中起到關鍵作用。一個基因序列上多聚腺苷酸化位點(polyadenylation site，PAS)的數(shù)量以及每個PAS的利用程度不同會引起選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)的形成，從而導致同一個基因產生多個轉錄本，對基因的表達及功能的發(fā)揮產生重要影響。本研究利用豬轉錄組數(shù)據(jù)，從全基因組水平挖掘豬的PAS，通過研究PAS與基因表達量的關系，進一步研究PAS對性狀的影響。主要結果如下:<

8、br>　　2.1基于大規(guī)模轉錄組數(shù)據(jù)挖掘豬的多聚腺苷酸化位點。利用本實驗室感染藍耳病病毒前后的通城豬和大白豬中肺泡巨噬細胞的轉錄組數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)庫下載的豬的轉錄組數(shù)據(jù)，包括12種組織、細胞及精子等的轉錄組數(shù)據(jù)，共計120億個reads，其中有194萬個含有Poly(A)或Poly(T)的reads成功比對到基因組上，對這些reads進行PAS挖掘，共得到28363個PASs。
　　2.2對PAS位置進行注釋。依據(jù)目前豬基因組注釋文

9、件中基因的位置信息，對本研究得到的28363個PASs進行位置注釋，共發(fā)現(xiàn)13033個(47％) PASs位于7403個基因中，其中有7900個PASs(61％)位于基因的3'UTR，3441個PASs(26％)位于基因的內含子區(qū)域，2187個PASs(17％)位于基因的ORF區(qū)域;利用所有轉錄組數(shù)據(jù)對豬的新轉錄本進行預測，并對剩余的15330個PASs進行位置注釋，結果表明，有6806個(24％) PASs位于預測的新轉錄本內部。即:

10、利用基因組注釋文件和預測新的轉錄本信息，共發(fā)現(xiàn)19839個PASs(70％)位于基因內部區(qū)域，8524個PASs(30％)位于基因間區(qū)域。
　　2.3 PAS在基因組和不同組織中的分布特性?；谪i基因組注釋文件中基因的位置信息，對基因及其3'UTR內的PAS分布進行分析，結果顯示，近41％的基因中存在至少兩個以上的PASs，這些PAS可促使同一基因產生多個轉錄本;而對基因內及其3'UTR中相鄰PASs間的距離分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)PAS

11、s(45％)間的距離很近(＜1Kb);對3'UTR中的PAS與終止子間的距離分析發(fā)現(xiàn)，PAS在3，UTR上的位置具有較大差異，該距離的中值為307nt;通過對肝臟及睪丸組織中PAS進行挖掘，分別得到12777和14375個PASs，而兩個組織相同的PAS僅有4752個，占總數(shù)量的21％，并且，兩個組織中相同PAS的利用率差異很大，說明PAS具有組織特異性。
　　2.4利用Pearson方法對PAS和基因表達量進行相關性分析。本研究

12、利用源于不同雄性激素水平的睪丸和肝臟組織的轉錄組數(shù)據(jù)，對每個數(shù)據(jù)中基因的表達量、相應基因內PAS的數(shù)量及覆蓋的reads數(shù)進行統(tǒng)計，利用Pearson方法對PAS與基因表達量進行相關性分析。結果表明，基因內PAS數(shù)量與基因表達量呈中度正相關(0.4＜r＜0.6，p＜0.01)，PAS覆蓋的reads數(shù)與基因表達量呈強正相關(0.6＜r＜0.8，p＜0.01)。
　　2.5 PAS利用率對雄性激素水平及在細菌感染機體過程中的作用分析

13、。依據(jù)睪丸和肝臟組織中雄性激素水平的高低，對不同數(shù)據(jù)中挖掘的PAS進行差異利用率分析，結果表明，肝臟中有272個PASs在低雄性激素組中的利用率顯著高于在高雄性激素組中利用率(p＜0.05，|log2FC|≥1)，對差異利用率PAS所在的109個基因進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與到了固醇及脂肪酸的代謝、甾類激素的合成和細胞色素P450的代謝等過程(p＜0.05);在睪丸中，有260個PASs的利用率具有極顯著差異的(p＜0.05，|

14、log2FC|≥1)，相應的基因有163個，基因功能富集分析表明，很多基因同時參與精子形成和細胞周期等過程(p＜0.05)。對感染沙門氏菌前后的轉錄組數(shù)據(jù)進行PAS分析，發(fā)現(xiàn)38個PASs在感染后有較高的利用率，相關基因有28個，而41個PAS在感染前有較高的利用率，相關基因有26個(p＜0.05，|log2FC|≥1)。分別對感染前后高利用率PAS的相關基因進行功能富集分析，結果顯示，感染后高利用率PASs的相關基因參與免疫應答和細胞