波生坦對慢性高原性肺動脈高壓的治療作用及其機(jī)制.pdf

1、高原性肺動脈高壓是指正常人移居高原后由于低壓低氧，引起肺小動脈功能及器質(zhì)性改變致使肺動脈壓力增高。早期高原性肺動脈高壓系因急性低壓低氧引起的肺小動脈收縮；長期慢性低壓低氧則引起肺血管及心室肌重構(gòu)，最終發(fā)展為難治性梗阻性肺動脈高壓。低壓低氧是高原性肺動脈高壓(HAEPH)產(chǎn)生的根本原因。迄今為止，慢性HAEPH的機(jī)制尚未完全闡明，而且仍缺乏理想的治療方法。因此，對慢性HAEPH的發(fā)病機(jī)制及治療措施的研究已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。

2、r>　　波生坦(bosentan)是一種相對分子質(zhì)量低的特異性競爭性的雙重內(nèi)皮素(ET)受體阻滯劑，由加拿大Acetlion公司和美國GenentetchInc公司聯(lián)合開發(fā)，商品名為Tracleer(全可利)。目前主要用于治療原發(fā)性肺動脈高壓和硬皮病相關(guān)性肺動脈高壓。但是，波生坦是否可以逆轉(zhuǎn)長期低壓低氧引起的肺動脈高壓，從而達(dá)到治療高原性肺動脈高壓的目的，目前尚缺乏相關(guān)報道。
　　5-羥色胺(serotonin，5-HT)是肺內(nèi)的

3、一種縮血管因子，具有促血管平滑肌細(xì)胞收縮和增殖的作用。5-HT與5-HT1B受體(serotonin receptor 1B，5-HT1B)結(jié)合增加血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的活性從而導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平下降，引起肺動脈收縮。5-HT可以通過5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，5-HTT)和/或5-HT1B受體促使肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和肥大，引起肺血管重塑

4、。研究已證實：5-HTT和5-HT1B受體均參與了原發(fā)性肺動脈高壓和常壓低氧性肺動脈高壓的形成。但是，5-HT、5-HTT和5-HT1B受體在慢性HAEPH形成中的變化以及波生坦對它們的影響卻鮮有報道。
　　因此，本課題擬從整體、器官、分子三個層次初步探討了：(1)波生坦對慢性HAEPH的治療作用及其機(jī)制；(2)慢性HAEPH大鼠體內(nèi)5-HT、5-HTT和5-HT1B受體的變化，以及波生坦對其變化的影響。
　　一、波生坦降低

5、了慢性HAEPH
　　1．方法
　　(1)采用動物低壓低氧艙模擬海拔5000～5500米高度氣壓環(huán)境(大氣壓約50kPa)，建立慢性HAEPH的大鼠模型。健康SD大鼠隨機(jī)分為6組(每組10只)：正常組，模型3周組，模型4周組，模型6周組，安慰劑組和波生坦組。除正常組外，其余各組置于自制低壓低氧艙進(jìn)行間斷性低氧，每天8h。模型3周組大鼠、模型4周組大鼠分別于低壓低氧艙中飼養(yǎng)3周和4周，模型6周組、安慰劑組和波生坦組大鼠在低壓低

6、氧艙中飼養(yǎng)6周。自第4周起，在低壓低氧前，分別給予安慰劑組大鼠和波生坦組大鼠生理鹽水2ml或波生坦(bosentan)100mg?kg-1?d-1灌胃。
　　(2)用微導(dǎo)管自右頸外靜脈插管至右心室及肺動脈，測定平均肺動脈壓(mPAP)及右心室收縮期終末壓力(RVSP)等肺血流動力學(xué)指標(biāo)。同時放置導(dǎo)聯(lián)電極記錄和監(jiān)測大鼠心電圖(ECG)和心率(HR)等指標(biāo)。
　　(3)稱量大鼠右心室(RV)和左心室(LV)加室間隔(S)重量，以

7、RV/(LV+S)比值反映右心室肥厚程度。稱量大鼠全肺重量(PM)和體重(BM)，以PM/BM比值反映肺水腫程度。
　　(4)光鏡下觀察肺小動脈形態(tài)學(xué)變化，并用圖像分析儀測量與呼吸性細(xì)支氣管及肺泡管伴行的肺小動脈的外徑(ED)、動脈中層壁厚(WT)，然后計算血管壁中層厚度占血管外徑的百分比(WT％)，以反映肺血管重建程度。光鏡下觀察非肌性肺小動脈(直徑40～60μm)管壁雙層彈力膜的完整性，計算非肌性肺小動脈的肌化程度，反映肺動脈

8、的肌化程度。
　　(5)分別用硝酸還原酶法和放射免疫分析法檢測大鼠血液及肺組織NO和ET-1的水平。
　　(6)用化學(xué)比色法測定大鼠肺組織中結(jié)構(gòu)性一氧化氮合酶(constitutiveNOS，cNOS)和總一氧化氮合酶(NOS)的活性。
　　2．結(jié)果
　　(1)大鼠低壓低氧3周后己形成肺動脈高壓(PAH)。模型3周組大鼠的mPAP及RVSP明顯升高，WT％、RV/(LV+S)比值、PM/BM比值以及肺小動脈肌化度

9、均顯著增加。光鏡下觀察，肺小動脈管壁增厚，管腔縮小，發(fā)生肌化的肺小動脈數(shù)量明顯增多。上述指標(biāo)隨低壓低氧時間的延長而加重，至6周時更為顯著。但各組大鼠HR無明顯變化。
　　(2)低壓低氧6周后，安慰劑組大鼠的mPAP和RVSP水平均顯著高于正常組。而波生坦組大鼠的mPAP和RVSP水平均顯著降低，和正常組大鼠相比已沒有顯著差異。
　　(3)波生坦組大鼠的肺血管重建指標(biāo)WT％和肺小動脈肌化度均恢復(fù)至正常大鼠水平，其右心室肥厚指標(biāo)

10、RV/(LV+S)比值、肺水腫指標(biāo)PM/BM比值和安慰劑組大鼠相比均顯著降低。
　　(4)低壓低氧6周后，安慰劑組大鼠血液和肺組織中NO水平明顯降低，而ET-1的水平顯著增高。與安慰劑組大鼠相比，波生坦組大鼠血液和肺組織中NO的水平均明顯升高。雖然波生坦組大鼠血漿中ET-1的水平高于安慰劑組，但其肺組織中ET-1的水平已經(jīng)顯著下降。
　　(5)安慰劑組大鼠肺組織中cNOS和總NOS的活性明顯降低。與安慰劑組相比，波生坦組大鼠

11、肺組織中cNOS和總NOS的活性顯著升高，其值和正常組相比沒有顯著差異。
　　3．結(jié)論
　　(1)波生坦不僅顯著降低了慢性HAEPH大鼠的mPAP、RVSP，減輕了右心室肥厚和肺水腫，而且成功逆轉(zhuǎn)了肺血管重構(gòu)。提示：波生坦對慢性HAEPH有明確的治療作用。
　　(2)波生坦可以降低慢性HAEPH大鼠肺組織中ET-1的含量，增加cNOS和總NOS的活性，從而使大鼠循環(huán)和肺組織中NO的含量升高。這可能是波生坦治療慢性HAE

12、PH的機(jī)制之一。
　　二、波生坦對慢性HAEPH大鼠體內(nèi)5-HT水平及其肺動脈中5-HTT和5-HT1B受體表達(dá)的影響
　　1．方法
　　(1)30只健康SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只)：正常組、安慰劑組和波生坦組。正常組于常壓環(huán)境中飼養(yǎng)，其余兩組置于低壓低氧艙進(jìn)行間斷性低氧，每天8h。自第4周起，在低壓低氧前，分別給予安慰劑組大鼠和波生坦組大鼠生理鹽水2ml或波生坦(bosentan)100mg·kg-1·d-1灌

13、胃。
　　(2)酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELASA)檢測大鼠的無血小板血漿和肺組織中5-HT的水平。
　　(3)免疫組織化學(xué)和Westernblot法觀察大鼠肺動脈和肺組織中5-HTT、5-HT1B受體的表達(dá)變化。
　　2．結(jié)果
　　(1)和正常大鼠相比，安慰劑組大鼠無血小板血漿和肺組織中5-HT的水平均顯著升高。波生坦灌胃3周后，慢性HAEPH大鼠的血漿和肺組織中5-HT的水平均顯著降低。
　　(2)免疫組織

14、化學(xué)和Westernbolt結(jié)果顯示：和正常組大鼠相比，安慰劑組大鼠肺動脈和肺組織中5-HTT、5-HT1B受體的表達(dá)顯著增多。而波生坦組大鼠肺動脈和肺組織中5-HTT、5-HT1B受體的表達(dá)均低于安慰劑組。
　　3．結(jié)論
　　(1)低壓低氧不僅引起了大鼠體內(nèi)5-HT水平的升高而且促使大鼠肺動脈管壁中5-HTT和5-HT1B受體的過度表達(dá)。這證實了5-HT系統(tǒng)的激活參與了慢性HAEPH的形成。
　　(2)波生坦既能有效