甜瓜果實蔗糖代謝相關(guān)酶基因的克隆、表達分析及Anti-CmSPS1對甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜瓜(Cucumis melon L.)是世界性的重要園藝作物，糖分組成及含量是衡量甜瓜品質(zhì)的主要依據(jù)之一。蔗糖、葡萄糖和果糖是甜瓜果實中主要的可溶性糖，其含量和組成對果實品質(zhì)起重要作用，它們的含量和組成嚴格受蔗糖代謝酶調(diào)控，而蔗糖代謝酶包括蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)和轉(zhuǎn)化酶(AI)，其中SPS活性的提高和AI活性的降低是蔗糖積累的首要條件，改變SPS的活性可能會改變蔗糖的代謝模式。因此，利用現(xiàn)代分子生物學的方法改變蔗

2、糖代謝酶的活性對甜瓜品質(zhì)育種具有重要的意義。 本研究首先通過RT-PCR及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實蔗糖磷酸合成酶基因和酸性轉(zhuǎn)化酶基因全長cDNA，研究了這兩個基因的組織器官表達特異性和果實發(fā)育過程中的表達特異性，然后構(gòu)建了甜瓜果實SPS基因的反義表達載體。以甜瓜自交系M01-3為材料，通過子房注射法將甜瓜果實反義蔗糖磷酸合成酶基因進行了甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了轉(zhuǎn)基因植株。研究的主要結(jié)果如下： 1.通過RT-PC

3、R及3'、5'RACE技術(shù)克隆到甜瓜果實SPS基因和AI基因全長cDNA。測序結(jié)果表明SPS基因全長為3373 bp，編碼1054個氨基酸，在GenBank中登記號為DQ521271，命名為CmSPS1；AI基因全長為2178 bp，編碼636個氨基酸，在GenBank中登記號為EU260044，命名為CmS-AIV1。 2.通過Northem Blot分析得知，在甜瓜的不同組織中，CmSPS1基因在葉片、莖、果實中均有表達，而

4、在根和花中未檢測到該基因的表達，而CmS-AIV1基因在花和果實中表達，在根、莖、葉中不表達。在甜瓜果實生長發(fā)育過程中，在20 DAP之前沒有檢測的CmSPS1基因的表達，在20 DAP之后，該基因開始表達，到果實成熟時表達量最高；而CmS-AIV1基因的表達情況與之相反，隨著果實的成熟表達量逐漸降低。 3.將克隆在pMD18-T載體上的甜瓜CmSPS1基因用Hinc Ⅱ和Kpn Ⅰ進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后回

5、收830 bp的片段，將該片段與經(jīng)Kpn Ⅰ和Sma Ⅰ酶切的植物表達載體pROK2進行連接，這樣獲得的重組質(zhì)粒CmSPS1片段反向插入35S啟動子之后，TNOS終止子之前。經(jīng)酶切和PCR檢測表明，我們成功構(gòu)建了甜瓜反義CmSPS1基因的植物表達載體。 4.本研究利用子房注射法將anti-CmSPS1基因?qū)μ鸸线M行了遺傳轉(zhuǎn)化，應(yīng)用PCR和PCR Southern Blot技術(shù)對后代進行了分子鑒定，在獲得的800株成苗中，共鑒定出