鴨腺病毒1型病毒全基因組感染性BAC克隆的構(gòu)建.pdf

1、本文通過基因組的限制性內(nèi)切酶分析以及動物實(shí)驗(yàn)，篩選了一株低毒力的DAV1病毒QU，利用Cre/loxP系統(tǒng)，通過位點(diǎn)特異性重組將細(xì)菌人工染色體(BAC)插入DAV1病毒QU株基因組中，構(gòu)建了其感染性全基因組克隆。 首先以一株來源于鵪鶉的DAV1病毒QU株為材料，提取其基因組DNA，分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ和Eam1105Ⅰ進(jìn)行消化。瓊脂糖凝膠電泳顯示除了EcoRⅠ，其余4種酶切產(chǎn)物都與已報(bào)道

2、的DAV1病毒AV127株的全序列分析結(jié)果不同。這表明病毒QU株與雞源DAV1病毒的基因型有較大不同。為了確定其致病性，分別用病毒QU株和雞源DAV1病毒HS株對20日齡SPF雞進(jìn)行攻毒。4天后檢測其血清生化指標(biāo)的變化情況并與對照組進(jìn)行比較，同時(shí)取其肝臟進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。發(fā)現(xiàn)QU組的各項(xiàng)生化指標(biāo)均沒有明顯變化，肝組織形態(tài)與對照組相同；HS組的谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽堿脂酶和血淀粉酶顯著降低，總蛋白、白蛋白和球蛋白極顯著降低，并且肝細(xì)

3、胞大量壞死。結(jié)果表明，HS株病毒主要引起雞肝臟和胰腺的損傷，具有較強(qiáng)的致病性；QU株病毒對雛雞的生理狀況幾乎沒有影響，毒力很弱，可以用作禽用基因疫苗或基因治療的候選病毒載體。 隨后，本研究通過雙酶切，將一段兩端各有一個(gè)loxP位點(diǎn)的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)盒插入到質(zhì)粒pAD20與QU病毒基因組同源的序列中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pADloxH。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將重組質(zhì)粒pADloxH與QU株基因組共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，

4、用96孔板稀釋法篩選純化表達(dá)GFP的重組病毒Vgfp。將其與Cre重組酶質(zhì)粒pCre共轉(zhuǎn)染CEF，篩選純化GFP陰性的重組病毒Vlox。將病毒Vlox與質(zhì)粒plndigoBAC-5和pCre共轉(zhuǎn)染CEF，利用X-gal篩選lacZ陽性的重組病毒Vbac。提取病毒vBAC基因組DNA，通過CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，獲得質(zhì)粒pVbac。用EcoRⅠ酶切質(zhì)粒pVbac和病毒QU株基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)酶切產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果一致。