TLR4信號通路促進腫瘤細胞分泌MIP-3alpha參與腫瘤免疫逃逸的研究.pdf

1、慢性感染和炎癥被認為是導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一,研究證明促炎性細胞因子和趨化因子長期存在于某部位可能會導致慢性炎癥的發(fā)生,局部微環(huán)境中促炎性細胞因子的長期存在和反復的炎癥反應可能誘導腫瘤的發(fā)生,但目前對于慢性炎癥導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的相關機制并不十分清楚.腫瘤免疫逃逸發(fā)生的機制一直是生物醫(yī)學領域的研究熱點之一,近年來腫瘤細胞表面表達的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關系倍受關注.

2、 我們設想腫瘤細胞是否可以通過分泌大量的趨化因子,進而吸引更多的不成熟和/或具有免疫抑制性的細胞亞群進入瘤內,繼而參與機體的免疫逃逸.MIP-3a(巨噬細胞炎癥蛋白)是屬于CC亞族的趨化因子,組成性表達在多種來源的上皮細胞,其特異性受體是CC-趨化因子受體6(CCR6),趨化淋巴細胞和DC.很多浸潤大量非成熟DC的實體瘤本身都檢測到表達MIP-3a. 在以上研究背景和假設的基礎上,我們在本課題中選擇了幾株不同組織來源的小鼠

3、腫瘤細胞株作為研究對象,首先探討了腫瘤細胞表面TUR4的表達和誘導表達;進一步研究了TLR4信號對腫瘤細胞趨化因子表達譜的影響;分析了腫瘤細胞中的MIP-3a是否能夠被誘導表達以及與TLR4信號的相關性;最后對于調控MIP-3a分泌的相關信號通路以及MIP-3a究竟通過怎樣的機制促進腫瘤生長和發(fā)展等做了初步的探討. 研究結果發(fā)現,多數腫瘤細胞如結腸癌細胞株C126、肺癌細胞株3LL、黑色素瘤細胞株B16和B16F10、纖維瘤細胞

4、株L929和乳腺癌細胞株4T1都組成性地表達TLR4且表達量較高,TLR4的天然配體LPS能上調CT26表達TLR4,但對其它幾種腫瘤細胞B16、4T1、3LL的TLR4的表達無明顯影響.隨后我們用RT-PCR方法檢測了TLR4信號對這四種腫瘤細胞趨化因子的表達譜的影響,結果顯示,LPS刺激后,四種腫瘤細胞某些免疫抑制性因子和趨化因子的表達變化不盡相同:在檢測的四種腫瘤細胞中均組成性表達MCP-1,L2S誘導后無明顯變化:RNATES在

5、兩種腫瘤細胞中(B16,CT26)組成性表達,LPS誘導后無明顯變化,但12S刺激12h后在4T1腫瘤細胞中RNATES表達增加,而在3LL腫瘤細胞中,LPS卻下調RNATES表達:趨化因子IP-10只有在4T1細胞中受LPS刺激后上調其表達;L2S上調3LL細胞的VEGF的表達以及3LL和CT26中TECK的表達;LPS上調3LL、B16、CT26細胞中MIP-3a的表達,其中CT26細胞株的變化最為明顯.因TLR4信號對不同組織來源

6、的腫瘤細胞趨化因子表達譜的影響不盡相同,但MIP-3a的變化基本一致,MIP-3a是能夠顯著趨化不成熟DC和T細胞的重要趨化因子,腫瘤微環(huán)境中存在的TGF-β、vEGF、IL-8等大量抑制性細胞因子可阻滯DC的分化成熟,或者誘導分化為某些調節(jié)性DC.因此,我們推測TIR4信號是否可以通過促進腫瘤細胞MIP-3a的分泌而參與機體的腫瘤免疫逃逸呢? TLR4信號能夠促進小鼠結腸癌細胞CT26分泌趨化因子MIP-3a.那么,其可能的分

7、子信號機制如何呢?首先我們對MAPKs和NF-κB兩條信號途徑進行研究,結果發(fā)現,結腸癌細胞CT26在靜息狀態(tài)下MAPKs激酶中p38、ERK1/2和JNK1/2信號分子的磷酸化水平表達不高,LPS的刺激后,這三種信號分子的磷酸化水平都顯著增加.同樣地,LPS的刺激后的小鼠結腸癌細胞CT26中NF-κB信號途徑也被激活,表現在胞漿內磷酸化的IκBa降解及核內NF-κB蛋白表達增高.但究竟是哪條或哪些通路參與了LPS誘導的MIP-3a的分

8、泌呢?我們利用相關信號分子特異性的抑制劑SB203580、U0126、SP600125和PDTC分別阻斷p38、ERK1/2、JNK1/2和NF-κB信號通路后,ELISA檢測MIP-3a的分泌量,結果顯示ERK1/2和NF-κB特異性的抑制劑U0126和PDTC明顯抑制了LPS誘導的MIP-3a的分泌,可推斷ERK和NF-κB信號通路的活化與CT26分泌MIP-3a直接相關;有趣的是,研究結果顯示JNK抑制劑SP600125不但沒有阻

9、斷MIP-3a的分泌,反而促進了MIP-3a分泌,那么,其相關機制怎樣呢?我們推測SP600125是否可能通過激活ERK和NF-kB信號通路,從而促進了MIF-3a的分泌.因此,我們進一步檢測了JNK抑制劑SP600125作用后CT26細胞內ERK和p-IKB的活化情況,結果發(fā)現,JNK抑制劑明顯激活ERK的磷酸化水平,但對p-IKB的磷酸化水平并沒有明顯影響,表明JNK抑制劑可以通過活化ERK信號通路促進MIP-3a分泌增加.

10、 以上研究結果顯示,TLR4信號可以通過激活ERK和NF-KB信號通路,增加腫瘤細胞MIP-3a的分泌.那么,MIP-3a的分泌如何參與TKR4信號介導的腫瘤細胞免疫逃逸?近年來大量文獻報道MIP-3a能趨化不成熟DC,并促進腫瘤細胞的生長.為了闡明TLR4.信號介導MIP-3a的分泌是否參與結腸癌細胞CT26的免疫逃逸,我們首先利用Transwell系統(tǒng)檢測了MIP-3a對非成熟DC(immatureDC,imDC)的趨化作用,CT2

11、6細胞經LPS刺激和未刺激,在第36小時收集培養(yǎng)上清,重組MIP-3a蛋白100ng/ml作為陽性對照.結果發(fā)現,LPS刺激的CT26腫瘤細胞培養(yǎng)上清對非成熟DC的趨化作用顯著高于未刺激細胞的培養(yǎng)上清,且趨化非成熟DC的細胞數量與陽性對照組相當,為了明確腫瘤培養(yǎng)上清MIP-3a的作用,我們利用抗MIP-3a的中和性抗體100ug/ml對MIP-3a進行阻斷,結果顯示,MIP-3a的中和性抗體阻斷組顯著降低了腫瘤培養(yǎng)上清對非成熟DC的趨化

12、作用,進一步證實腫瘤培養(yǎng)上清中MIP-3a在趨化非成熟DC過程中發(fā)揮了重要作用.有文獻報道,趨化因子的存在可以促進腫瘤的發(fā)展,某些趨化因子能促進腫瘤細胞的增殖,從而增進腫瘤的生長.MIP-3a是否能夠直接促進CT26腫瘤細胞的增殖呢?我們用CFSE標記CT26細胞,用不同濃度L2S在不同時間點刺激后,FACS檢測細胞的增殖情況,結果顯示,在LPs的不同作用時間點、各濃度的12S對CT26的增殖并沒有明顯的促進作用. 綜上所述,腫