延邊流行株犬瘟熱病毒H基因的原核表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染而引起的急性傳染病，具有接觸性強、發(fā)病率和死亡率高等特點，并可引起機體免疫抑制，是危害犬科類動物生命較為嚴重的傳染病之一，嚴重制約了我國養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護業(yè)的發(fā)展。因此，建立一種快速、高效的特異性檢測方法對于該病的防控具有十分重要的意義。
　　本試驗采集延邊地區(qū)自然感染犬瘟熱病毒患病犬的組織病

2、料，提取CDV全基因組，利用RT-PCR方法擴增CDV-H基因，將其克隆至pMD18-T simple vector載體，構建重組克隆質粒pMD18T-CDV-H，并將pMD18T-CDV-H與pGEX-4T-1載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，構建重組表達質粒pGEX-CDV-H，轉化至BL21(DE3)表達菌株，通過對不同溫度、IPTG濃度、Amp+濃度和誘導時間等條件的優(yōu)化進行重組蛋白的表達，利用SDS-PAGE凝膠電泳對表達產(chǎn)物

3、進行分離鑒定。將誘導表達出的重組蛋白進行純化，利用Western-blot方法分析純化蛋白的反應原性，并將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗CDV蛋白多克隆抗體，檢測其抗體效價，并利用純化抗原建立間接ELISA方法。
　　結果顯示，CDV-H基因全長約為1824 bp，編碼607個氨基酸，該序列與近幾年GenBank中收錄的國內外9株CDV-H基因核苷酸序列同源性為88.9-99.8％，氨基酸序列同源性為85.8-9

4、9.5％。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，重組融合蛋白的分子量約為103 Ku，以包涵體形式存在。純化蛋白經(jīng)Western-blot分析鑒定，具有良好的反應原性，免疫BALB/c小鼠可誘導其產(chǎn)生抗CDV-H抗體，抗體效價為1∶64，證明該重組表達蛋白具有良好的免疫原性。通過對間接ELISA方法最適條件的篩選，得到重組蛋白最佳包被濃度為6.88μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶100，抗原最佳包被條件為4℃過夜，血清最佳作用條件為37℃1h，3％脫