2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題（含答案詳解+作文范文）_第1頁
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文檔簡介

1、目的：利用重疊延伸拼接(splicing by overlap extension，SOE)PCR技術(shù)構(gòu)建相對排列的U6/H1雙啟動(dòng)子siRNA表達(dá)框架(siRNAexpression cassettes，SECs)，并針對人端粒酶hTERT基因外顯子不同片段構(gòu)建三條U6/H1雙啟動(dòng)子SECs，通過對肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞端粒酶hTERT基因表達(dá)進(jìn)行RNA干擾來考察U6/H1啟動(dòng)子SECs的干擾作用，從而為siRNA的制備及腫瘤基因治

2、療探索新的途徑。 方法：分別以pSUPER質(zhì)粒和pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒為模板，根據(jù)端粒酶hTERT基因外顯子核酸序列(genebank (NM_198253))1778-1796，2650-2668，1943-1961三個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異引物，利用重疊延伸拼接PCR方法構(gòu)建兩端為相對排列的U6和H1啟動(dòng)子、中間部分為與端粒酶hTERT特定序列同源的可雙向轉(zhuǎn)錄的SECs。將該產(chǎn)物純化后用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，

3、用適時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)量，用TRAP-PCR銀染法定性檢測端粒酶活性，來觀察構(gòu)建的U6、H1雙啟動(dòng)子SECs的RNA干擾作用。 結(jié)果：2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物顯示：第一階段PCR反應(yīng)產(chǎn)物單U6啟動(dòng)子正義SECs片段、單H1啟動(dòng)子反義SECs片段長度分別為335bp和245bp，第二階段PCR片段長度分別為反應(yīng)產(chǎn)物U6、H1雙啟動(dòng)子SECs片段長度為561bp。將四段雙啟動(dòng)子SECs產(chǎn)

4、物純化后分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測端粒酶hTERT mRNA及活性，針對hTERT(genebank NM_198253)1778-1796，2650-2668，1943-1961的U6、H1雙啟動(dòng)子SECs對后hTERT mRNA量顯著下降，端粒酶活性明顯降低。hTERTmRNA表達(dá)的抑制率分別為37.0％、50.1％和37.0％。處理組的相對端粒酶活性抑制率分別為55.0％、76.5％和47.6％。而陰性對照SECs無RNA干擾作

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