RNA干擾抑制VEGF-C基因表達與胃癌淋巴管生成的實驗研究.pdf

1、鄭州大學博士學位論文RNA干擾抑制VEGF-C基因表達與胃癌淋巴管生成的實驗研究姓名：周慧聰申請學位級別：博士專業(yè)：消化內(nèi)科指導教師：李繼昌20070518鄭州大學2 0 0 7 屆博士學位論文 R N A 干擾抑制V E G F - C 基因表達與胃癌淋巴管生成的實驗研究等。R N A 干擾( R N A i n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項特異性抑制基因表達的新方法，研究顯

2、示，R N A 干擾是目前效應(yīng)最強的反義技術(shù)，對同一靶目標，半抑制濃度的s i R N A ( s m a l l i n t e r f e r e n c e R N A ，s i R N A ) 是已磷硫?；押塑账岬膌 o o 一1 0 0 0 倍。R N A 干擾，指當細胞中導入與內(nèi)源性m R N A 編碼區(qū)同源的雙鏈R N A C d o u b l e s t r a n d e dR N A ，d s R N A ) 時

3、，該m R N A 發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默( p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n e s i l c n c i n s , P T G S ) 。由于其高效性、特異性，R N A 干擾已成為對哺乳動物細胞進行基因選擇性分析的方法，并成為獲得性和遺傳性疾病潛在的治療手段．R N A 干擾抑制腫瘤細胞生長的功能在體內(nèi)外實驗中已得

4、到證實。目前較為常用制備s i R N A 的方法包括化學合成s i R N h 、體外轉(zhuǎn)錄合成s i R N A 、用R N a s e l I I 消化長片段d s R N A ，利用質(zhì)?；虿《据d體表達s i P 州h ，P c R 方法制備s i R N A 表達框架。其中通過質(zhì)粒等表達載體在細胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄s i R N A s 不僅經(jīng)濟和容易操作，而且R N A i 表達載體可以進行較長期研究。帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持

5、續(xù)抑制靶基因的表達，這使得哺乳動物細胞內(nèi)基因表達長期沉默成為可能。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株為長期進行生物化學分析和細胞表型的評價提供了可能。本研究設(shè)計了2 條針對V E 6 F - - C 基因不同靶點的寡核昔酸序列，應(yīng)用質(zhì)粒構(gòu)建s i R N A 表達載體并轉(zhuǎn)染胃癌細胞株S G C 一7 9 0 1 經(jīng)R T —P C R 、免疫細胞化學法、w e s t e r nb l o t 檢測V E G F - C m R N A 和蛋白質(zhì)的表達水

6、平，研究其干擾V E G F - C 基因表達的效應(yīng)，篩選抑制效果最佳的序列，為迸一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。通過計數(shù)法檢測轉(zhuǎn)染s i R N A 后S G C 一7 9 0 1 細胞的增殖變化探討s i R N A 抑制V E G F - C 基因表達對胃癌細胞的效應(yīng)。近年來，裸鼠移植瘤己成為人類腫瘤實驗?zāi)Ｐ偷闹匾ぞ?。本研究通過建立V E G F - C 表達抑制的移植瘤模型探討V E G F - C 基因的功能及其與胃癌淋巴管生成、淋