吳茱萸堿和小檗堿對結(jié)腸癌HT29細胞的抗癌作用及機理研究.pdf

1、大腸癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在我國，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，生活方式的改變，大腸癌的發(fā)病率也日趨增高，盡管采用了手術(shù)、化療、放療等多種治療方法，但效果都不盡理想。 現(xiàn)代研究者普遍認為：端粒酶的激活是腫瘤形成過程中的關(guān)鍵步驟。端粒酶已被廣泛認為可作為腫瘤的標(biāo)記物以及抗腫瘤治療的靶點，因此目前有大量科學(xué)家致力于從端粒酶途徑治療大腸癌的研究。由于中藥抗腫瘤作用具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點，同時其毒副作用低，不

2、易產(chǎn)生耐藥性，日益受到人們的重視。近幾年中藥抑制端粒酶活性成為腫瘤治療的熱點之一。 隨著現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，表型遺傳學(xué)異軍突起，已成為許多學(xué)科的研究前沿，在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的研究也逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注。諸多研究表明在腫瘤發(fā)生的過程中，除了DNA序列改變外，表型遺傳修飾在腫瘤形成過程中具有重要作用。主要包括DNA甲基化和組蛋白乙?；?。其中DNA甲基化是目前研究的最多、也是最深入的一種表型遺傳修飾表達機制。端粒和

3、端粒酶與細胞增殖、分化、癌變及細胞凋亡有關(guān)，多種轉(zhuǎn)錄因子參與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的調(diào)節(jié)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對端粒酶活性的調(diào)節(jié)具有重要的作用。 本研究所對以吳茱萸、黃連、青黛為主藥的加味左金丸及其主要成分吳茱萸堿、小檗堿、靛玉紅防治胃腸癌的藥理作用和臨床研究已進行了多年，研究表明，加味左金丸能降低MNNG誘發(fā)大鼠胃及十二指腸癌的發(fā)生，減輕病理損傷；小檗堿可以明顯抑制 BGC823、MGC803 等胃癌細胞的增殖，

4、降低集落形成率、細胞分裂指數(shù)及軟瓊脂集落形成能力，促進細胞分化，降低腫瘤轉(zhuǎn)移等，同時還可以抑制 ras 和 c-erbB2基因的表達。臨床方面，楊傳標(biāo)等觀察了連黛膠囊 (加味左金丸)治療30例中晚期胃腸腫瘤患者的療效及其與中醫(yī)證型的關(guān)系，結(jié)果表明連黛膠囊治療胃癌、大腸癌在改善臨床癥狀和提高生存質(zhì)量方面有顯著療效，其中對熱毒(濕熱)證的臨床癥狀療效最好。我們的課題正是在此基礎(chǔ)上，從端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶的表型遺傳修飾方面探討加味左金丸對治

5、療大腸癌的分子藥理機制。研究過程中發(fā)現(xiàn)，加味左金丸中的主要單體靛玉紅的作用不太明顯，故本研究在此基礎(chǔ)上進一步研究吳茱萸堿和小檗堿對大腸癌的抗癌作用機制。 一．實驗研究: 1．細胞培養(yǎng)條件的建立 采用體外培養(yǎng)細胞的方法，研究了吳茱萸堿和小檗堿從端粒酶及其逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT甲基化途徑對HT29細胞的抗癌作用。選用的細胞為結(jié)腸腺上皮癌HT29細胞株，建立和穩(wěn)定了整個研究工作中所需要的細胞培養(yǎng)條件。 主要對細胞傳

6、代、細胞凍存和細胞復(fù)蘇條件進行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，通過顯微鏡觀察了細胞形態(tài)，采用了WST-8 法測定了細胞生長曲線。 結(jié)果顯示，HT29細胞平鋪于培養(yǎng)瓶底面積超過瓶底80％時，即可以比例1:2傳代；按5×10<'6>細胞加入凍存液1ml這樣的密度凍存；復(fù)蘇時，液氮罐中取出的細胞，于38℃迅速在1～2min 內(nèi)解凍，細胞接種次日貼壁良好。生長曲線顯示，細胞以1×10<'5>/ml接種后2～3日生長旺盛，此時，細胞處于倍增期前后，適

7、合實驗。 2．吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞的生長抑制和細胞凋亡的作用 首先在體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株HT29細胞，采用 WST-8 方法測定吳茱萸堿和小檗堿對HT29 細胞生長抑制作用，并篩選了兩種藥物作用的最佳時間、有效濃度。結(jié)果顯示：經(jīng)過篩選后，作用時間取 72h，吳茱萸堿取 7.5，15，30μM 3個濃度，鹽酸小檗堿取 52.5，105，210μM 3個濃度用于后續(xù)實驗；吳茱萸堿和小檗堿對結(jié)腸癌 HT29細胞具有

8、顯著生長抑制作用，具有劑量依賴效應(yīng)關(guān)系和時間依賴效應(yīng)關(guān)系；相差顯微鏡動態(tài)觀察藥物作用后，細胞出現(xiàn)胞體縮小，變圓，胞漿混濁，增殖變慢等生長受到抑制的形態(tài)方面的變化。 采用 Annexin V -FITC/PI 雙染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化，檢測結(jié)果提示：吳茱萸堿和小檗堿能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，與空白對照組比較有顯著差異性，隨藥物濃度的增加，凋亡率逐漸增加，表現(xiàn)為量效依賴性；熒光電鏡下觀察可見到細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂、染色體邊集和凋

9、亡小體等典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。 同時本研究還表明吳茱萸堿和小檗堿單獨應(yīng)用有抗大腸癌的作用，而二者合用對HT29 細胞產(chǎn)生的抑制細胞增殖作用，與單藥組吳茱萸堿的抑制率比較無顯著差異性，說明吳茱萸堿和小檗堿對其生長抑制無明顯的協(xié)同作用。 3．吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞端粒酶活性的影響 端粒酶的激活是腫瘤形成過程中的關(guān)鍵步驟，它已被廣泛認為可作為腫瘤的標(biāo)記物以及抗腫瘤治療的靶點。許多研究表明，端粒酶在大腸癌中高

10、表達，通過觀察吳茱萸堿和小檗堿對 HT29 細胞端粒酶活性的影響，探討其對人結(jié)腸癌細胞的作用機制。本實驗采用了原位TRAP 方法測定端粒酶活性，結(jié)果表明吳茱萸堿和小檗堿作用HT29細胞72h 后，端粒酶活性明顯降低，且隨藥物濃度逐漸增大，抑制端粒酶活性的作用逐漸增強，呈劑量依賴性；而二者協(xié)同用藥作用時，和正常對照組比較，端粒酶活性無明顯變化，表明吳茱萸堿和鹽酸小檗堿聯(lián)合用藥與單獨作用無明顯變化，進一步證明二者無明顯協(xié)同作用。

11、4．吳茱萸堿和小檗堿對HT29細胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERTmRNA表達的影響 端粒酶的活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和衰老機制密切相關(guān)，而hTERT作為端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄組分，與端粒酶活性的表達具有密切相關(guān)性，能夠反映出端粒酶的活性，且多種腫瘤調(diào)控因子均通過對 hTERT 的調(diào)節(jié)來影響端粒酶的活性，是更加理想的端粒酶抑制靶點。所以我們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)的方法，檢測人結(jié)腸癌HT29細胞中 hTERT mRNA 的表達水平

12、，探討其對大腸癌細胞端粒酶活性的影響及其抑癌機理。研究結(jié)果表明吳茱萸堿和小檗堿能夠降低HT29細胞中的hTERT mRNA的表達，且隨著藥物濃度的增加，表達逐漸降低，具有劑量依賴效應(yīng)。hTERT mRNA 表達代表端粒酶活性，hTERT mRNA 表達下降，提示端粒酶活性降低，由此可證明吳茱萸堿和小檗堿影響大腸癌端粒酶活性是通過降低hTERT表達這一途徑來完成的。 二．結(jié)論: 通過對細胞傳代、凍存和復(fù)蘇條件進行優(yōu)化，建立

13、了穩(wěn)定的HT29細胞培養(yǎng)條件，為后續(xù)的實驗研究奠定了良好的基礎(chǔ)；吳茱萸堿和小檗堿對大腸癌HT29 細胞具有顯著生長抑制作用，該抑制作用與誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)；能夠抑制HT29細胞端粒酶的活性；能夠降低HT29細胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERTmRNA的表達，間接抑制端粒酶活性；二者無協(xié)同作用。 三．不足之處: 雖然研究工作取得了部分階段性成果，但由于研究方法不太成熟及時間等方面的原因，研究中也存在著一些不太滿意的方面，主要有兩個

14、方面：一是由于研究方法不太成熟，關(guān)于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT甲基化程度檢測方面的實驗未預(yù)期完成；另一方面，我們只是選取了加味左金丸的主要有效單體吳茱萸堿和小檗堿來研究其抑癌機理，并不能代表中藥復(fù)方加昧左金丸的抑癌作用，如果探討中藥復(fù)方的抑癌機理研究，需要運用中藥血清藥理學(xué)，它能夠真實地反映藥物在體內(nèi)的整體作用，實現(xiàn)體外實驗和體內(nèi)實驗的結(jié)合，使實驗結(jié)果和在體實驗有很好的一致性，并能夠為臨床治療大腸癌提供實驗依據(jù)。 四．展望:

15、 本論文是通過對細胞生長抑制、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制端粒酶活性和降低端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 hTERT基因表達這四個方面層層深入研究，證明了吳茱萸堿和小檗堿對大腸癌HT29 細胞的抑癌作用機理，為今后從轉(zhuǎn)錄因子 c-myc、SP1 等調(diào)控基因表達更深層面去研究中藥抑癌的作用機制奠定了一定的基礎(chǔ)，也為開發(fā)新藥提供了實驗依據(jù)。但本研究中表明，吳茱萸堿和小檗堿在HT29細胞生長抑制及端粒酶活性檢測方面，二者無協(xié)同作用，可能通過其他機制參與了端粒酶活性的