restin與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化的關(guān)系及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本課題主要就restin的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面作進(jìn)一步探討，進(jìn)而為認(rèn)識(shí)restin生理功能以及與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供有價(jià)值的信息。 首先在早幼粒細(xì)胞性白血病HL-60細(xì)胞系中用ATRA誘導(dǎo)restin表達(dá)，RT-PCR方法檢測其表達(dá)水平與誘導(dǎo)時(shí)間之間的關(guān)系；在該過程中同時(shí)檢測細(xì)胞生物學(xué)功能的改變。研究發(fā)現(xiàn)早幼粒細(xì)胞性白血病HL-60細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)1天后即可檢測到restin的表達(dá)，且表達(dá)水平不隨藥物作用時(shí)間點(diǎn)的繼續(xù)延長而發(fā)

2、生明顯變化；在restin表達(dá)第2天時(shí)即出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并隨著表達(dá)的持續(xù)而阻滯愈來愈明顯；同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)較明顯的向中幼粒、晚幼粒細(xì)胞分化的特征，并也隨著表達(dá)的持續(xù)分化而特征愈加明顯。這種時(shí)間的一致性提示restin與抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞分化密切相關(guān)，從而建立restin與細(xì)胞分化等的相關(guān)性。 在簡單了解restin的基本生物學(xué)功能的基礎(chǔ)上，明確它的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，闡明它在維甲酸信號(hào)通路中的位置和所發(fā)揮的作用有助于建立其與腫瘤

3、等疾病的發(fā)生發(fā)展以及防治的聯(lián)系。為此，分析并克隆了restin基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游約2.1Kb序列并構(gòu)建熒光報(bào)告系統(tǒng)，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)證明此片段具有啟動(dòng)子活性。對該段序列用啟動(dòng)子分析軟件進(jìn)行分析，預(yù)測有3個(gè)可能的核心啟動(dòng)子區(qū)，存在3個(gè)STAT1、1個(gè)C/EBP和1個(gè)P53轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)這些位點(diǎn)的不同位置對此序列依次進(jìn)行截短，構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒RP2(1520bp)、RP3(1417bp)、RP4(945bp)、RP5

4、(800bp)、RP6(333bp)，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，檢測經(jīng)ATRA刺激前后報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)變化，結(jié)果顯示RP2-RP5均接受ATRA的調(diào)控，且調(diào)控強(qiáng)弱不同，說明有多個(gè)順式作用元件參與調(diào)控。而截去最后一個(gè)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子STAT1結(jié)合位點(diǎn)GAS元件的RP6則不再接受ATRA的調(diào)控，因此推測鄰近ATG的GAS元件可能為調(diào)控restin轉(zhuǎn)錄的一個(gè)重要順式作用元件，STAT1可能通過此元件參與調(diào)控過程。此外，將RP1的3’端(即AT

5、G上游)333bp截去后重新構(gòu)建的RP7則失去啟動(dòng)子活性，說明此區(qū)域包含了核心啟動(dòng)子。但因?yàn)?273bp至-1是restin的5’UTR，因此-333bp至-273bp即為核心啟動(dòng)子。為確立STAT1在ATRA誘導(dǎo)restin表達(dá)中的作用，我們分別在STAT1可誘導(dǎo)表達(dá)的MCF-7和STAT1不可誘導(dǎo)表達(dá)的MDA-MB-231兩種乳腺癌細(xì)胞系中探討了restin的表達(dá)調(diào)控。MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞在相同條件下經(jīng)ATRA刺激2

6、4小時(shí)后，RT-PCR方法檢測restinmRNA水平變化。結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中經(jīng)ATRA刺激后可檢測到restin的表達(dá)；但在MDA-MB-231細(xì)胞中，ATRA刺激前后均無法檢測到restin的表達(dá)。將構(gòu)建好的只含有一個(gè)GAS元件的RP5分別轉(zhuǎn)染這兩種細(xì)胞系，結(jié)果顯示RP5僅在MCF-7細(xì)胞系中接受ATRA的調(diào)控。但當(dāng)MDA-MB-231中有外源表達(dá)的STAT1時(shí)RP5則接受ATRA的調(diào)控，且加入IFN-γ后有增強(qiáng)作用。這些結(jié)

7、果表明，轉(zhuǎn)錄因子STAT1確實(shí)參與了ATRA對restin基因表達(dá)調(diào)控的過程。 綜上所述，本課題在研究restin的基本生物學(xué)功能時(shí)發(fā)現(xiàn)它與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化密切相關(guān)；為明確其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以確立其與正常生理功能以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，構(gòu)建了它的不同長度的啟動(dòng)子熒光報(bào)告系統(tǒng)，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)變化而定位了核心啟動(dòng)子區(qū)，并發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控的順式作用元件和可能與此元件相作用的轉(zhuǎn)錄因子STAT1確實(shí)參與了ATRA誘導(dǎo)restin基因