白黎蘆醇上調(diào)人肺泡上皮細(xì)胞SIRT1表達(dá)抑制高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:探討去乙?；?(SIRT1)氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞（HPAEpiC細(xì)胞）凋亡的作用，探討其激動劑白藜蘆醇(Res)對高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)凋亡的保護(hù)作用。
　　方法:將體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細(xì)胞HPAEpiC株作為研究對象。首先采用MTT法找出最佳Res藥物作用濃度，再將HPAEpiC細(xì)胞隨機(jī)分為三組:對照組、高氧組、Res組。對照組:在含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng);高氧組:細(xì)胞第一

2、次換上述培養(yǎng)液時后，通入3L/min的含95％氧氣的高純混合氣，10～15min后置于50ml/LCO2培養(yǎng)箱密閉中培養(yǎng);Res組:第一次換液時用終濃度為100μmol/L的等量SIRT1誘導(dǎo)劑Res培養(yǎng)，隨后通入3L/min的含95％氧氣的高純混合氣，10～15min后置于50ml/LCO2培養(yǎng)箱密閉中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后檢測以下指標(biāo):倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并照相;采用SP細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-9/

3、XIAP/SIRT1蛋白的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧簇及其膜電位的變化，Western blot檢測細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率變化。
　　結(jié)果:(1) MTT法提示，最佳Res藥物濃度為100μmol/L。(2)倒置相差顯微鏡下，對照組細(xì)胞生長狀態(tài)佳，貼壁率高，細(xì)胞活力好，呈扁平不規(guī)則多角形，圓形核位于細(xì)胞中央，約占1/3～1/2，細(xì)胞數(shù)量多、排列緊密、連接成片，懸浮細(xì)胞很少。高氧組細(xì)胞生

4、長狀態(tài)差，貼壁率低，細(xì)胞活力差，橢圓形或圓形細(xì)胞多，細(xì)胞間隙增大，連接松散，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯增多。Res組細(xì)胞生長狀態(tài)、貼壁、細(xì)胞活力欠佳，活細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量較高氧組有所增加、懸浮細(xì)胞數(shù)較高氧組減少，但未達(dá)對照組水平。與進(jìn)口一次性塑料培養(yǎng)瓶比較，HPAEpiC細(xì)胞在國產(chǎn)玻璃培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)佳，在一次性培養(yǎng)瓶中不能存活。(3)免疫組化結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組24h后HPAEpiC細(xì)胞的caspase-9/XIAP/S

5、IRT1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與高氧組相比，Res組24h后HPAEpiC細(xì)胞的caspase-9/XIAP/SIRT1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:線粒體內(nèi)活性氧顯示紅色熒光，細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光。對照組活性氧表達(dá)最低，高氧組活性氧表達(dá)最高，Res組介于兩者之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(5)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組細(xì)胞線粒體膜電位（△Ψm）明顯

6、下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與高氧組相比，Res組△Ψm有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但未達(dá)到對照組水平(P＜0.05)。(6) Western blot結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Res組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(7)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:高氧組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)