小鼠干擾素λ3的表達(dá)及其生物學(xué)活性初步研究.pdf

1、根據(jù)氨基酸序列和受體的差異,干擾素(IFN)分為I型、II型和新發(fā)現(xiàn)并命名歸類的III型。IFN-λ3(又名IL-28B)是2003年發(fā)現(xiàn)的III型IFN-λ家族成員中的一員。跟其一起發(fā)現(xiàn)還有結(jié)構(gòu)類似的IFN-λ1(又名IL-29)、IFN-λ2(又名IL-28A)。IFN-λ3基因結(jié)構(gòu)與IL-10類似,氨基酸水平卻與IFN接近。小鼠的IFN-λ家族僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)成員,即IFN-λ2和IFN-λ3。研究發(fā)現(xiàn)mIFN-λ3 mRNA表達(dá)于小鼠

2、血液細(xì)胞、肺、胰腺、胎盤、腦等多種組織中,其表達(dá)受病毒感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等的刺激誘導(dǎo)。
　　自1957年IFN被發(fā)現(xiàn)以來,有關(guān)IFN的研究就不斷深入。I型IFN已被認(rèn)可臨床應(yīng)用于多種腫瘤和病毒性疾病的治療,但其療效往往很有限而且對(duì)于不同疾病差異較大,且常出現(xiàn)疲勞、發(fā)熱等不良反應(yīng)。新發(fā)現(xiàn)的IFN-λs的功能與I型IFN相似,但其受體跟I型IFN的受體卻有所不同,極有可能替代I型IFN應(yīng)用于臨床治療。IFN-

3、λs的受體在人體中的分布不同于I型IFN,使得其能選擇性作用于不同靶細(xì)胞、靶基因并發(fā)揮其獨(dú)特生物學(xué)活性。
　　本研究用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建小鼠IFN-λ3的原核及真核表達(dá)載體、進(jìn)行原核和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)mIFN-λ3蛋白以及對(duì)其生物學(xué)功能的初步研究,為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。本文主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　一、根據(jù)GenBank中小鼠IFN-λ3基因序列(AY869696)設(shè)計(jì)特異性引物,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),克隆出

4、mIFN-λ3基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)。將其克隆入pcDNA3.1(+)載體,構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-mIFN-λ3。
　　二、根據(jù)小鼠IFN-λ3基因序列設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物,用PCR技術(shù),從購置的表達(dá)克隆質(zhì)粒(EX-Mm18539-M03)中克隆出mIFN-λ3成熟蛋白編碼區(qū),將其克隆入載體pET-44(+),構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-44-mIFN-λ3,經(jīng)測(cè)序鑒定其編碼基因與GenBank中小鼠IFN-λ3基因序列

5、(AY869696)一致。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)菌株,然后在25°C用IPTG誘導(dǎo),表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在。
　　三、利用已構(gòu)建好的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-mIFN-λ3在293細(xì)胞中表達(dá)。使用MTT法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)生的mIFN-λ3目的蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞A549和SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)影響,并通過在A549、SW620細(xì)胞中誘導(dǎo)MxA抗病毒蛋白的產(chǎn)生研究mIFN-λ3的抗病毒機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)