Megsin及p38MAPK信號(hào)通路在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致終末期腎衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因,如何早期有效防治DN已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱切關(guān)注的課題。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為是在以高血糖引起的糖脂代謝紊亂的基礎(chǔ)上,多種因素綜合作用的結(jié)果。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)炎癥及氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。腎小球系膜細(xì)胞(glomeru

2、lar-mesangial eell,GMC)是腎臟重要的固有細(xì)胞(inherent cell)之一,在腎臟的組織結(jié)構(gòu)和生理功能方面發(fā)揮著重要作用,具有產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子、吞噬和清除異物等多種功能。GMC也是多種致病因子作用的主要靶細(xì)胞,在病變進(jìn)展中扮演著重要角色。Megsin是一種系膜細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因,其表達(dá)產(chǎn)物屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteaseinhibitor,serpin)超家族成員。Serpin家

3、族成員眾多,功能涉及凝血、纖溶、炎癥、細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、消化等多個(gè)系統(tǒng)。Megsin可作用于其底物纖溶酶(plasmin)并抑制其活性,從而直接或間接抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解。研究表明,在IgA腎病、DN和大鼠抗Thy-1腎炎模型中megsin表達(dá)上升,提示megsin與系膜細(xì)胞增生和系膜外基質(zhì)積聚密切相關(guān)。目前有關(guān)megsin具體生物學(xué)功能還很不清楚,其在DN中的作用機(jī)制鮮有深入研究報(bào)道。研究表明,高血糖、炎癥細(xì)胞因子、活性氧、血管

4、緊張素Ⅱ等均可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated Protein Kinase,p38MAPK)信號(hào)通路,它不僅參與細(xì)胞的存活、分化和凋亡等過(guò)程,還在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用,是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及細(xì)胞問(wèn)黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)增多與p38MAPK通路激活密切相關(guān)。MCP-1及ICAM-1過(guò)度表達(dá)可介導(dǎo)大量巨噬細(xì)胞趨化和激活

5、,加重糖尿病腎損傷。DN時(shí)MCP-1和ICAM-1水平可作為衡量炎性反應(yīng)程度的指標(biāo)。糖尿病狀態(tài)下,腎組織中活性氧產(chǎn)生大量增加,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)生成增多,總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶活性下降,引起腎損害。腎素--血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的激活,是DN發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是

6、其主要效應(yīng)分子。因此,抑制AngⅡ的產(chǎn)生并干擾其作用是DN治療的關(guān)鍵。纈沙坦是血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptorⅠ antagonist,AT1Ra),新近研究發(fā)現(xiàn)這類(lèi)藥物具有一定的非依賴(lài)降壓的腎臟保護(hù)作用。
　　 本研究分別構(gòu)建megsin質(zhì)粒和megsin siRNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染CD-1小鼠和小鼠腎臟系膜細(xì)胞,從整體、細(xì)胞和分子水平系統(tǒng)觀察megsin、p38MAPK信號(hào)通路、炎癥因子MCP

7、-1、ICAM-1及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MDA、T-SOD、GSH-PX的變化,及其之間的相互關(guān)系,探討megsin參與早期DN發(fā)生的作用機(jī)制;并通過(guò)腎小球系膜細(xì)胞藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn),觀察血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑纈沙坦對(duì)megsin表達(dá)及p38MAPK信號(hào)通路活化的影響,探討纈沙坦腎臟保護(hù)作用的機(jī)制,最終為篩選從基因或蛋白水平阻斷megsin致病作用的有效途徑,進(jìn)一步闡明DN發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制及其防治提供一條新思路。
　　 方法:

8、　　 第一部分:健康雄性CD-1小鼠48只,戊巴比妥鈉腹腔麻醉(5mL/kg)后行左腎切除術(shù),2周后切口完全愈合。小鼠隨機(jī)分為兩組:左腎切除對(duì)照組(CN,n=24)和糖尿病組(DM,n=24)。其中DM組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,150 mg/kg溶于0.1mol/L枸椽酸緩沖液中,pH值4.5),CN組只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液,72h后尾尖取血,血糖儀測(cè)定血糖,尿糖試紙測(cè)定尿糖,血糖≥16.7

9、mmol/L,尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型。分別于注射STZ后1、2、4和12周末每組取6只小鼠,收集血、尿和腎組織標(biāo)本,測(cè)定血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(serumcreatinine,Scr)、腎重/體重比值(Kidney weight/body weight ratio,KW/BW)、24h尿蛋白(Urinary protein,UP);光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變,免疫組織化學(xué)染色和Westem bl

10、ot檢測(cè)腎組織megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表達(dá)。
　　 第二部分:構(gòu)建megsin表達(dá)質(zhì)粒和megsin siRNA質(zhì)粒。選擇CD-1小鼠共30只,經(jīng)單側(cè)腎切除后,隨機(jī)選取6只作為正常對(duì)照組(A組,n=6),其余24只一次性腹膜腔注射STZ(150mg/kg),制備糖尿病模犁,成模后隨機(jī)選取6只作為糖尿病組(B組,n=6),剩余18只經(jīng)尾靜脈分別注射空質(zhì)粒,megsin質(zhì)粒和m

11、egsin siRNA質(zhì)粒,每周1次,分別為(CN、D組、E組,各組n=6),實(shí)驗(yàn)共4周。于第4周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本,測(cè)定BG、Scr、KW/BW、UP,光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變,免疫組化和Western blot檢測(cè)腎組織megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá),分別應(yīng)用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定腎組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量

12、及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性的變化。
　　 第三部分:用含10％胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞,傳代后接種于96孔板,無(wú)血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h。用MTT法觀察不同時(shí)間(12、24、48h)高糖及megsin對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。將系膜細(xì)胞分為5組:低糖組(A組,非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖組(B

13、組,非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+空質(zhì)粒組(C組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的系膜細(xì)胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+megsin轉(zhuǎn)染組(D組,穩(wěn)定表達(dá)megsin的系膜細(xì)胞,30mmol/L葡萄糖)和高糖+megsin siRNA轉(zhuǎn)染組(E組,脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒,30mmol/L葡萄糖)。分別在6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12、24和48小時(shí)末收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞上清液。應(yīng)

14、用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot測(cè)定各組總蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1的表達(dá),分別應(yīng)用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定細(xì)胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原含量。
　　 第四部分:取小鼠系膜細(xì)胞種植于96孔板,采用MTT法分別檢測(cè)低糖、高糖以及干預(yù)藥物纈沙坦在不同時(shí)間、

15、不同藥物濃度對(duì)系膜細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。采用6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞,將細(xì)胞分成3組:LG組(5.5mmol/L葡萄糖);HG組(30mmol/L葡萄糖)和HG+Val組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L纈沙坦),于刺激的48h收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞上清液。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)各組總蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表達(dá),分別應(yīng)用硫代

16、巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定細(xì)胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中IV型膠原含量。
　　 結(jié)論:
　　 1體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),糖尿病狀態(tài)下megsin在腎小球表達(dá)增強(qiáng),伴有腎小球系膜增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚等腎臟病理改變,提示megsin在糖尿病腎病發(fā)生機(jī)制中起一定作用。
　　 2過(guò)表達(dá)megsin可上調(diào)腎組織或系膜細(xì)胞p-

17、p38MAPK、MCP-1、ICAM-1的表達(dá)及MDA含量,降低T-SOD、GSH-PX的活性,促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增牛及系膜外基質(zhì)沉積,提示megsin促發(fā)早期糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制可能與p38MAPK信號(hào)通路激活有關(guān),但具體作用途徑有待進(jìn)一步研究闡明。
　　 3 megsin siRNA質(zhì)粒和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦可分別從基因水平和蛋白水平下調(diào)megsin的表達(dá),進(jìn)而抑制p38MAPK信號(hào)通路激活,下調(diào)MCP-1、ICAM