瘢痕疙瘩與正常皮膚成纖維細(xì)胞中結(jié)締組織生長因子差異表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、課題目的：瘢痕疙瘩是一種病理性瘢痕，一直以來都是臨床上的棘手問題，目前尚無理想的治療方法。結(jié)締組織生長因子(ConnectiveTissueGrowthFactor，CTGF)是重要的促進(jìn)纖維化因子，本研究的目的是：比較CTGF在體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，以及對血清刺激的反應(yīng)；使用RNA干擾技術(shù)從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞中CTGF的表達(dá)，觀察對成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響，從而了解CTG

2、FRNA干擾能否起到逆轉(zhuǎn)過度瘢痕增生的作用；研究介導(dǎo)CTGF在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)的信號途徑、轉(zhuǎn)錄因子活化情況以及對CTGF啟動(dòng)子的調(diào)控，為闡明瘢痕疙瘩形成原因提供依據(jù)，并為治療尋找新的、更具特異性的靶點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)一CTGF在瘢痕疙瘩和正常成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)及RNA干擾研究
　　采用方法：使用定量實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）比較CTGF及其下游基因-I型膠原在瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。設(shè)計(jì)合成

3、三條CTGF小干擾RNA（siRNA）序列并克隆到pRNAT-6.1/Neo載體中，分別轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞，24h后行qRT-PCR檢測CTGF和I型膠原的表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線。
　　主要結(jié)果：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表達(dá)的CTGF和I型膠原mRNA顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞（p<0.05）。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在血清刺激后1小時(shí)內(nèi)CTGF的表達(dá)量迅速升高，峰值約為刺激前的8-17倍；與之相反，CTGFmRNA在正常皮

4、膚成纖維細(xì)胞血清刺激后僅少量上升，約為刺激前的2倍。合成的三個(gè)CTGFsiRNA載體均顯著降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的CTGFmRNA水平達(dá)一半以上，其中CTGFsiRNA3的干擾效果最強(qiáng)（p<0.05），并能顯著減少瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的I型膠原mRNA水平（p<0.05）。CTGFsiRNA3載體能顯著降低瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞的增殖速度（p<0.05），使瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖速度降低到近似于對照組正常皮膚成纖維細(xì)胞

5、的水平。
　　實(shí)驗(yàn)二CTGF在瘢痕疙瘩和正常成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
　　采用方法：血清刺激前半小時(shí)在培養(yǎng)基中加入放線菌酮至終濃度0.1mg/mL，特異性阻斷新蛋白質(zhì)的合成，qRT-PCR檢測CTGF的表達(dá)。在血清刺激前半小時(shí)給予人工合成的小分子信號途徑抑制劑進(jìn)行預(yù)處理，分別為：PI3K抑制劑wortmannin，終濃度為100nM；ERK抑制劑PD98059，終濃度為50mM；p38MAPK抑制劑SB203580

6、，終濃度為10mM；JNK抑制劑SP600125，終濃度為25mM；以及TGF-βI型受體抑制劑SB431542，終濃度為0.1μM、0.5μM、1μM和10μM，空白對照組僅加入溶劑DMSO。分別于血清刺激后0、1、6、12、24h收集RNA，行qRT-PCR檢測CTGF的表達(dá)水平。分別在血清刺激后0min、15min、30min、1h、2h、3h、6h和24h收集瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)，行Westernblot檢測MA

7、PK、PI3K和TGF-β信號途徑分子的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)。
　　主要結(jié)果：放線菌酮預(yù)處理后給予血清刺激，CTGF在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)不但不被抑制，反而出現(xiàn)顯著升高（p<0.05），說明了CTGF在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的血清反應(yīng)不需要合成新蛋白質(zhì)，而僅僅是通過改變信號蛋白的磷酸化狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)定位等就能完成，符合即刻早期基因的特征。在所研究的MAPK和PI3K信號途徑抑制劑中，只有JNK抑制劑SP600125能夠顯著抑制血清誘

8、導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過度表達(dá)CTGF（p<0.05），說明JNK信號途徑參與了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在血清刺激后過度表達(dá)CTGF的過程。此外TGF-βI型受體抑制劑SB431542對血清刺激誘發(fā)的CTGF表達(dá)升高具有顯著的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系，其中10μM組的抑制作用最強(qiáng)，CTGF的表達(dá)量僅為對照組的48％（p<0.05）。說明TGF-β信號途徑也參與了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在血清刺激后過度表達(dá)CTGF的過程。Westernblot發(fā)

9、現(xiàn)ERK、P38和JNK的蛋白表達(dá)水平在血清刺激前后沒有明顯變化，然而其磷酸化水平在血清刺激后出現(xiàn)顯著變化。對比瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ERK的磷酸化過程兩者間并沒有明顯差異，然而P38和JNK的磷酸化在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中則明顯強(qiáng)于正常皮膚成纖維細(xì)胞，表現(xiàn)在刺激后15分鐘內(nèi)磷酸化水平就出現(xiàn)顯著升高，持續(xù)到刺激后的24h；而在正常皮膚成纖維細(xì)胞中，P38的磷酸化發(fā)生相對較晚，到刺激后2h才出現(xiàn)，24h前就已經(jīng)消失。正常皮膚成纖

10、維細(xì)胞中JNK的磷酸化強(qiáng)度相對較弱，且在6h之內(nèi)消失。在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ATF-2、Elk-1和c-JUN都在15分鐘內(nèi)迅速發(fā)生磷酸化，并且在24h內(nèi)都保持在高水平，而在正常皮膚成纖維細(xì)胞中，該磷酸化過程非常短暫。另外一些信號分子的磷酸化在瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞間沒有差異，例如，P90、AKT、TGF-βI型受體和SMAD3。我們的研究證明，在瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞受到血清刺激后，多條信號途徑都發(fā)生活化，包括ERK、P3

11、8、JNK、PI3K和TGF-β，其中JNK和TGF-β途徑介導(dǎo)了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在血清刺激后過度表達(dá)CTGF的過程，而只有JNK途徑在瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞間存在差異。
　　實(shí)驗(yàn)三CTGF啟動(dòng)子分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
　　采用方法：以PGL3-basic載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建出5個(gè)含有5’系列截短的CTGF啟動(dòng)子片段的報(bào)道基因載體，分別命名為：pCTGF-1999、pCTGF-736、pCTGF-625、pCTGF-140和

12、pCTGF-72。使用CTGF啟動(dòng)子報(bào)道基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞，檢測報(bào)道基因產(chǎn)物熒光酶的活性。將產(chǎn)生最強(qiáng)血清反應(yīng)的pCTGF-625載體的AP-1結(jié)合位點(diǎn)和SMAD結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，檢測報(bào)道基因產(chǎn)物熒光酶的活性。提取血清刺激前和刺激后1h的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞以及正常皮膚成纖維細(xì)胞的核蛋白，與AP-1結(jié)合位點(diǎn)或SMAD結(jié)合位點(diǎn)探針進(jìn)行孵育，行凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic

13、MobilityShiftAssay，EMSA）分離蛋白-DNA結(jié)合的條帶，分別加入c-Jun、SMAD2和SMAD3抗體行超遷移實(shí)驗(yàn)。
　　主要結(jié)果：基礎(chǔ)狀態(tài)下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中CTGF的啟動(dòng)子活性顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，啟動(dòng)子-140到-72的片段對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞CTGF基礎(chǔ)水平的高表達(dá)具有重要的調(diào)節(jié)作用。而-625到-140的片段包含著血清反應(yīng)調(diào)控元件。無論是AP-1結(jié)合位點(diǎn)還是SMAD結(jié)合位點(diǎn)的突變都足以消除C

14、TGF啟動(dòng)子報(bào)道載體的血清反應(yīng)，說明兩個(gè)位點(diǎn)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的CTGF高血清反應(yīng)性都是必需的。超遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與AP-1結(jié)合的條帶能被c-Jun抗體超遷移，而與SMAD結(jié)合的條帶能被SMAD2和SMAD3抗體超遷移，說明c-Jun、SMAD2和SMAD3均參與了血清刺激誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中CTGF高表達(dá)。
　　最終結(jié)論：瘢痕疙瘩與正常皮膚成纖維細(xì)胞存在著本質(zhì)上的差異，表現(xiàn)在：①瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的CTGF表達(dá)顯著高于正常皮

15、膚成纖維細(xì)胞，這種基礎(chǔ)狀態(tài)下的高表達(dá)由CTGF啟動(dòng)子-140到-72的片段調(diào)控；②瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對血清刺激產(chǎn)生過度的反應(yīng)，表現(xiàn)為高度表達(dá)CTGF。血清刺激后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中出現(xiàn)一系列信號途徑的活化，其中，正?；罨腡GF-β信號和過度放大的JNK信號分別活化下游分子SMAD2、SMAD3和c-Jun，這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)形成復(fù)合物，與CTGF啟動(dòng)子-625到-140的片段上的SMAD和AP-1位點(diǎn)結(jié)合，協(xié)同介導(dǎo)了CTGF的