細(xì)胞角蛋白-20單克隆抗體制備及在大腸癌檢測(cè)中的初步應(yīng)用研究.pdf

1、蘇州大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞角蛋白-20單克隆抗體制備及在大腸癌檢測(cè)中的初步應(yīng)用研究姓名：鳳敏華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：繆競(jìng)誠(chéng)20100501S t u d y o f t h e p r e p a r a t i o n a n d a p p l i c a t i o ni nc o l o r e c t a lc a n c e r o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i

2、e so f c y t o k e r a t i n —·2 0A b s t r a c tO b j e c t i v e ：T op r e p a r et h em o n o c l o n a la n t i b o d yo f c y t o k e r a t i n - 2 0a n de x p l o r et h ee x p r e s s i o n o f c y t o k e r

3、a t i n - 2 0i nc l i n i c a lb l o o d s a m p l e s w i t he o l o r e c t a lc a n c e r , p r o v i d i n go b j e c t i v e r e f e r e n c e ．M e t h o d s ：e D N A o f c y t o k e r a t i n - 2 0w a s a m p l i f

4、 i e db yR T - P C R u s i n g t h et o t a lR N Af r o mh u m a n e p i t h e l i a lc e l l sa st e m p l a t ea n dW a sc l o n e di n t ot h ep r o k a r y o t i cv e c t o ro fp E T 2 8 a ．T h er e c o m b i n a n t

5、 p l a s m i d W a sc o n f o r m e d b ye n z y m e d i g e s t i o na n d s e q u e n c i n g ，a n dt r a n s f o r m e d i n t o t h eb a c t e r i aB L 2 1 ( D E 3 ) c o m p e t e n tc e l l s ．T h e c y t o k e r a

6、t i n - 2 0p r o t e i nW a s p u r i f i e dt h r o u g h t h eN i - N T A c o l u m na f t e rb e i n gi n d u c e du n d e r p a r t i c u l a rt e m p e r a t u r ea n dI P T Gc o n c e n t r a t i o n ．B a l b ／c m

7、i c ew e r ei m m u n i z e db yt h e p u r i f i e dc y t o k e r a t i n ：2 0 w h i c hW a sf u l l ym i x e dw i t ht h eF r e u n d ’S a d j u v a n t ．A f t e rt h eb o o s t e ri m m u n i z a t i o n a n dd e t e

8、c t i o no f i m m u n e e f f e c t , t h es p l e e nc e l l sa n dm y e l o m a c e l l s w e r ef u s e d a n dc e l lc l o n e sw e r es c r e e n e db y E L I S A ．T h ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e db yW e s

9、 t e r nB l o t a s s a y ．As i m p l e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y k i t f o r c y t o k e r a t i n - 2 0d e t e c t i o nW a s p r e p a r e db yu s i n gt h es p e c i f i cm o n o c

10、 l o n a la n t i b o d i e sa n dc l i n i c a lb l o o ds a m p l e s o f n o r m a l p e o p l ea n d p a t i e n t s 、析t l lc o l o r e c t a lc a n c e r ．R e s u l t s ：T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E

11、 T 2 8 a - C K 2 0 W a s c o n s t r u c t e d a n dc y t o k e r a t i n 一2 0 W a sp u r i f i e d ．3 c e l l l i n e sw h i c hs e c r e ta n t i - c y t o k e r a t i n - 2 0m o n o c l o n a la n t i b o d i e sW e l

12、 ' es u c c e s s f u l l yo b t a i n e d ．1 0n o r m a ls e r u m s a m p l e sa n d 4 0s e r u m s a m p l e sf r o mp a t i e n t sw i t l lc o l o r e c t a lc a n c e rw e r ed e t e c t e dw i t ht h eE L I S

13、A k i tp r e p a r i n g 晰t 1 1t h e b e f o r e - m e n t i o n e da n t i ··c y t o k e r a t i n - 2 0m o n o c l o n a la n t i b o d y ．N o r m a l s p e c i m e n s w e r en e g a t i v e ．1 9 c a s e sf

14、r o mp a t i e n t sw i t hc o l o r e c t a lC a n C e rs p e c i m e n sw e r ep o s i t i v e 塒m ad e t e c t i o nr a t eo f 4 7 ．5 ％，a l l b e l o n g i n gt o t h eD u k e sp o i n t sc l a s sB ，C ，Dp e r i o d ．T

15、 h ed e t e c t i o n r a t e so f t h e B ，C ，Dp e r i o d sr e s p e c t i v e l yw e r e2 5 ％，4 1 ．7 ％，8 4 ．6 ％( 3 ／1 2 ，5 ／12 ，11 ／13 ) ．I ts h o w e d s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c