中間絲蛋白在大鼠視網(wǎng)膜發(fā)育和多種視網(wǎng)膜病變中的表達(dá).pdf

1、Nestin是中間絲蛋白的一種，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的神經(jīng)前體細(xì)胞/神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)，因此在基礎(chǔ)和臨床研究中它被廣泛用于鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中，Nestin陽性細(xì)胞主要位于睫狀體無色素上皮部位，因此很多學(xué)者認(rèn)為這些Nestin陽性細(xì)胞的存在是視網(wǎng)膜再生的基礎(chǔ)。最近研究報(bào)導(dǎo)，雞眼玻璃體腔注射NMDA后在Mnller細(xì)胞上出現(xiàn)Transtin的誘導(dǎo)表達(dá)，nanstin和Nestin屬同一類的可以在神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)的中間絲蛋

2、白，并推測(cè)病理情況下這些Mller細(xì)胞具有潛在神經(jīng)干細(xì)胞的特性，同時(shí)辦有研究表明人胎兒視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞表達(dá)Nestin，由此我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，從Mller細(xì)胞發(fā)育，體外和體內(nèi)三方面探討Nestin和另一種中間絲蛋白GFAP在Mller細(xì)胞上的表達(dá)規(guī)律及意義。 第一部分中間絲蛋白在大鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的表達(dá) 目的：探討中間絲蛋白Nestin和GFAP在大鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的定位及變化，中

3、間絲蛋白與Mller細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系及存在的意義。 方法：分別于大鼠生后0d，l，2，3，4，7，12和20w取大鼠眼球行矢狀位冰凍切片，免疫熒光雙標(biāo)確定中間絲蛋自在視網(wǎng)膜中的細(xì)胞定位，Real-time PCR方法進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1、出生Od Nestin免疫陽性細(xì)胞貫穿神經(jīng)視網(wǎng)膜的全層，主要定位于視網(wǎng)膜前體細(xì)胞放射狀排列的細(xì)長(zhǎng)纖維中，此時(shí)尚無明確的Mller細(xì)胞發(fā)生

4、，此時(shí)在視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)GFAP陽性細(xì)胞。 2、生后1w出現(xiàn)表達(dá)GS的Mller細(xì)胞，這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Nestin，不表達(dá)GFAP，GFAP陽性細(xì)胞仍然位于視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)。 3、生后2w至12w，Nestin在。Mller細(xì)胞上的表達(dá)逐漸減少直至消失，GFAP的表達(dá)沒有顯著變化，主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)論：在生后大鼠視網(wǎng)膜中，分化中的Mller細(xì)胞表達(dá)Nestin，隨視網(wǎng)膜發(fā)育日益成熟，Ne

5、stin表達(dá)逐漸減少，成年大鼠視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞不再表達(dá)Nestin，從新生鼠至成鼠Mller細(xì)胞都不表達(dá)GFAP。 第二部分中間絲蛋白在培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞上的表達(dá) 目的：探討中間絲蛋白Nestin和GFAP是否在體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞上表達(dá)及其意義。 方法：取生后7-12天新生鼠視網(wǎng)膜，參考文獻(xiàn)體外培養(yǎng)Mller細(xì)胞鑒定并純化，免疫熒光雙標(biāo)觀察Nes

6、tin和GFAP是否在Mller細(xì)胞上表達(dá)。 結(jié)果：用GS鑒定體外培養(yǎng)的第四代Mller細(xì)胞純度可達(dá)97﹪，所有Mller細(xì)胞均表達(dá)Nestin，陽性染色位于胞漿。培養(yǎng)的Mller細(xì)胞無GFAP陽性染色。 結(jié)論：所采用的方法可簡(jiǎn)單、快速地獲得高純度地Mller細(xì)胞。培養(yǎng)的Mller細(xì)胞表達(dá)Nestin，不表達(dá)GFAP。 第三部分中間絲蛋白在不同視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)

7、 目的：探討中間絲蛋白。Nestin和GFAP在不同視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)，隨病情進(jìn)展表達(dá)規(guī)律及其意義。 方法:制作青光眼、視神經(jīng)橫斷和缺氧三種視網(wǎng)膜損傷動(dòng)物模型，分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，從視網(wǎng)膜矢狀位切片和視網(wǎng)膜鋪片兩個(gè)方位行免疫熒光雙標(biāo)探討Nestin和GFAP在視網(wǎng)膜中的定位，并用Western blotting和Real-time PCR方法進(jìn)行定量檢測(cè)。 結(jié)果: 1、青光眼大鼠視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞

8、出現(xiàn)Nestin和GFAP的誘導(dǎo)表達(dá)，隨病情進(jìn)展其表達(dá)漸增強(qiáng)，并一直持續(xù)至術(shù)后3w。 2、視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞出現(xiàn)Nestin和GFAP的誘導(dǎo)表達(dá)，隨病情進(jìn)展其表達(dá)漸增強(qiáng)。 3、大鼠缺氧后視網(wǎng)膜Mllerr細(xì)胞出現(xiàn)Nestin和GFAP的誘導(dǎo)表達(dá)，立即給予高氧治療后，Nestin和GFAP在Mller細(xì)胞上的誘導(dǎo)表達(dá)明顯減弱，大鼠缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞上也出現(xiàn)Nestin的誘導(dǎo)表達(dá)，但給