乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗研究.pdf

1、乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒都是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而且乙型腦炎是一種人畜共患病，豬是乙腦病毒的主要放大宿主，因此對(duì)豬乙腦病毒的控制具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。兩種病原都是病毒，預(yù)防控制的主要措施除了常規(guī)的生物安全外，就是疫苗預(yù)防接種。目前尚無(wú)家畜專用的JEV疫苗株，主要用人類疫苗使用的弱毒株和強(qiáng)毒株。同時(shí)由于現(xiàn)代化養(yǎng)殖中豬群頻繁接種，對(duì)豬群造成很大的應(yīng)激，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。目前，國(guó)際上動(dòng)物用疫苗的

2、發(fā)展趨勢(shì)是標(biāo)記疫苗及其配套的監(jiān)測(cè)方法。鑒于此，本研究從乙腦病毒CQRC-1株擴(kuò)增了主要免疫原性基因E、PrM，構(gòu)建了兩株表達(dá)乙腦病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病病毒，即SA215(E)和SA215(F)，并對(duì)兩株重組病毒進(jìn)行生物學(xué)特性研究。同時(shí)重組疫苗接種后需要一種特異的血清學(xué)鑒別方法，鑒于此對(duì)乙腦病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS1進(jìn)行原核表達(dá)，并建立了ELSIA方法。其主要的研究?jī)?nèi)容如下： 1.乙腦病毒PrM、E、NS1和NS3基因的

3、克隆和測(cè)序 根據(jù)已報(bào)道的乙腦病毒CQRC-1株的核苷酸序列設(shè)計(jì)四對(duì)引物，在上下游引物的5’端引入一酶切位點(diǎn)。采用RT-PCR方法，擴(kuò)增了PrM、E、NS1和NS3基因，分別利用TA克隆插入pMD18-Tsimple載體，命名為PrM-T、E-T、NS1-T和NS3-T。測(cè)序結(jié)果表明E基因與已公布的SA14、JaGAr01和P3株核苷酸同源性分別為97、97、96％；PrM同源性分別為97、97、96％；NS1同源性高達(dá)99、98

4、、98％；NS3核苷酸同源性分別為99、98、98％；與報(bào)道的CQRC-1的對(duì)應(yīng)序列相同。 2.表達(dá)JEVE和PrM基因的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建 從E-T和PrM-T酶切獲得JEV的E基因和PrM基因，分別插入到PRVgI基因缺失通用轉(zhuǎn)移載體pPI-2.EGFP的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名為PPE和PPM。然后將質(zhì)粒PPE和PPM分別與PRV基因缺失株SA215基因組共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，通過(guò)同源重組，構(gòu)建了融合表達(dá)

5、JEVE基因和.JEVPrM基因的重組偽狂犬病毒株，命名為SA215(E)和SA215(F)。經(jīng)熒光檢測(cè)、PCR、Southern轉(zhuǎn)印雜交鑒定，結(jié)果表明SA215(E)和SA215(F)構(gòu)建成功；Western免疫印跡檢測(cè)表明JEVE基因和JEVPrM基因在重組病毒內(nèi)獲得表達(dá)，SA215(E)產(chǎn)生大小約90kD的融合蛋白；而SA215(F)產(chǎn)生大小約60kD融合蛋白，并且，表明產(chǎn)生的融合蛋白具有反應(yīng)原性。 3.重組病毒SA215

6、(E)、(F)部分生物學(xué)特性及穩(wěn)定性 SA215(E)、(F)和SA215對(duì)Vero細(xì)胞的致病變效應(yīng)、噬斑形態(tài)、一步法生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)以及電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)特征。結(jié)果表明SA215在插入了JEVE或PrM基因后，并不改變其生物學(xué)特性。SA215(E)、(F)連續(xù)傳6帶，在熒光顯微鏡下可見熒光，用PCR跟蹤檢測(cè)仍可擴(kuò)增出JEVE基因或PrM基因，表明SA215(E)、(F)至少在6代內(nèi)穩(wěn)定。 4.PRY-JEV二聯(lián)基因

7、工程疫苗對(duì)仔豬、小鼠和家兔的免疫原性和安全性試驗(yàn) 將重組偽狂犬病毒SA215(E)和(F)制成PRV-JEV二聯(lián)基因工程疫苗接種小鼠、家兔和仔豬。并對(duì)該疫苗的免疫原性和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。重組偽狂犬病毒SA215(E)、SA215(F)、SA215和野毒Fa株分別以105TCID50劑量接種小鼠，結(jié)果接種Fa株小鼠全部死亡，而接種SA215(E)、(F)和SA215株的小鼠全部存活；將四株分別以107TCID50接種家兔，接種Fa的

8、家兔在14天全都死亡，而接種SA215(E)、(F)和SA215株的家兔全部存活；初生仔豬接種SA215(E)和SA215(F)后除前三天體溫升高外，其他正常。這些結(jié)果表明SA215(E)和(F)株的毒力顯著低于PRV野毒株，而與親本株SA215相近，初步驗(yàn)證了重組病毒的安全性。 將PRV-JEV二聯(lián)基因工程疫苗SA215(E)、(F)及SA215分別加強(qiáng)免疫小鼠后，腹膜內(nèi)攻毒JEV強(qiáng)毒株CQRC-1，結(jié)果顯示SA215(E)能

9、100％(8/8)的保護(hù)，SA215(F)僅50％(4/8)保護(hù)，而SA215完全不能保護(hù)小鼠JEV攻毒(0/8);血清中和試驗(yàn)表明SA215(E)接種兩次后即首免后28天中和抗體滴度達(dá)1:20，而SA215(F)僅為1:4。SA215(E)、SA215(F)和SA215以107TCID50接種家兔兩次后，用107TCID50PRVFa株攻毒，SA215(E)、(F)和SA215都能100％(4/4)保護(hù)PRV強(qiáng)毒攻毒。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

10、(MTT法)結(jié)果顯示SA215(E)和(F)能誘導(dǎo)小鼠特異脾淋巴細(xì)胞的增殖;而T細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果顯示SA215(E)和SA215(F)免疫小鼠能有效提高T細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)小鼠的免疫水平。這些結(jié)果表明重組偽狂犬病毒SA215(E)和SA215(F)制成的PRY-JEV二聯(lián)基因工程疫苗能成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。以上結(jié)果表明重組病毒SA215(E)可以作為預(yù)防豬乙腦和偽狂犬病的二聯(lián)基因工程標(biāo)記疫苗候選株。 5.對(duì)已

11、構(gòu)建好的重組質(zhì)粒NS1-T和NS3-T通過(guò)雙酶切后，得到JEVNS1和NS3基因，將其亞克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，在IPTG的誘導(dǎo)下，NS1和NS3基因以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化，確立了NS1蛋白表達(dá)時(shí)的最佳誘導(dǎo)物濃度為0.4mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，誘導(dǎo)溫度為37℃。以純化的融合蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，優(yōu)化抗原最佳包被濃度為10μg/ml，血清稀釋度1:40，最適封閉液為1％BSA，血清反應(yīng)時(shí)間為9