苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶cDNA的克隆及特性研究.pdf

1、蛋白酶(Protease)主要參與蛋白質(zhì)的合成與降解，是所有生物體維持自身生長發(fā)育必不可少的一種酶。絲氨酸蛋白酶(serine protease，SP)是蛋白酶的重要成員，是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶。研究表明，昆蟲絲氨酸蛋白酶參與昆蟲消化、發(fā)育、先天免疫反應(yīng)和組織重建等重要的生理過程。由于在昆蟲消化和先天免疫中所起的重要作用，昆蟲絲氨酸蛋白酶已經(jīng)成為國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室的研究熱點(diǎn)，但當(dāng)前對昆蟲絲氨酸蛋白酶的研究主要以黑腹果蠅Droso

2、phila melanogaster和家蠶Bombyx mori等模式昆蟲居多，而對重要的農(nóng)業(yè)害蟲研究相對較少。苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca是大豆上重要的食葉害蟲，有時會引發(fā)局部嚴(yán)重危害，已成為主要的大豆害蟲之一。本試驗(yàn)以苜蓿夜蛾H.viriplaca為研究對象，克隆得到苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶基因，并命名為HvSP，該基因已登錄GenBank，登錄號為KT907053。用大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá)，再對

3、表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行變性、純化與復(fù)性，并以BTEE為底物進(jìn)行活性測定。同時對HvSP基因的mRNA在苜蓿夜蛾多個組織中的特異性表達(dá)進(jìn)行了研究，最后通過體外注射雙鏈RNA對HvSP基因的RNA干擾效果進(jìn)行檢測。本文主要研究結(jié)果如下:
　　(1) HvSP基因長1017 bp，開放閱讀框?yàn)?86 bp，編碼295個氨基酸，含有34 bp和95 bp的5'和3'非編碼區(qū)，N端含有17個氨基酸組成的信號肽。由HvSP基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為

4、30.8 kDa，等電點(diǎn)為8.27。NCBI Blast搜索發(fā)現(xiàn)HvSP推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源性達(dá)到46％～92％，其中同源性較高的均為胰凝乳蛋白酶，推斷本試驗(yàn)獲得的絲氨酸蛋白酶為胰凝乳蛋白酶。
　　(2)將本試驗(yàn)得到的HvSP基因與原核表達(dá)載體pET21b連接，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞里，用大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，目的菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯

5、示，含目的基因的HvSP重組質(zhì)粒在相對分子質(zhì)量接近30.8 kDa處，有一條明顯的目的條帶，與預(yù)測的蛋白分子量相近，而未插入目的基因的pET21b空載體未檢測到目的條帶，說明成功表達(dá)外源蛋白。再對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行變性、純化與復(fù)性，并以BTEE為底物進(jìn)行活性測定。酶活性測定結(jié)果表明在0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，pH為8.5時，復(fù)性的重組蛋白活性達(dá)到最高，為28.7 U/mL。
　　(3)熒光定量PCR結(jié)果表明，前

6、腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體都發(fā)現(xiàn)了HvSP基因的mRNA表達(dá)，但在唾腺中并沒有發(fā)現(xiàn)。和其他組織相比，HvSP基因在中腸中的表達(dá)量最高，是脂肪體表達(dá)量的14倍，并且與其他組織差異顯著(p＜0.05)，這表明HvSP基因主要存在于苜蓿夜蛾的中腸組織中。
　　(4) HvSP基因的RNA干擾結(jié)果表明，72 h后，注射了2μL含2μg/μL的dsHvSP的苜蓿夜蛾幼蟲相比對照組，基因表達(dá)量下降了65％，本試驗(yàn)說明，通過RNA干擾技術(shù)成