自擬涼血消疕湯治療尋常型銀屑病臨床觀察及其作用機制研究.pdf

1、目的： 1.觀察涼血消疕湯治療尋常型銀屑病的臨床療效及安全性。 2.通過體外傳代培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細胞株(HaCaT)，觀察不同濃度涼血消疕湯含藥血清對HaCaT細胞增殖、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響并探討其治療銀屑病的作用機制。為涼血消疕湯在臨床的廣泛應用提供理論基礎。 方法： 一．觀察涼血消疕湯治療尋常型銀屑病的臨床療效 1.病例來源2005年8月-2008年3月武漢市第一醫(yī)院皮膚

2、科銀屑病?？崎T診患者，臨床診斷尋常型銀屑病，皮損面積小于30％體表面積，就診前一月未經(jīng)口服中藥治療未接受免疫抑制劑治療的患者46例。 2.患者按隨機數(shù)字表法分為2組，兩組在年齡、性別、病程、嚴重程度上無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。治療組26例服用涼血消疕湯，每日一劑，分兩次口服。對照組20例服用郁金銀屑片，每日3次，每次4片。局部治療二組均采用10％煤焦油軟膏。每2周為1療程，連續(xù)觀察8周后根據(jù)銀屑病皮損面積和嚴重度

3、指數(shù)PASI評分系統(tǒng)，來評價臨床療效。同時監(jiān)測患者血尿常規(guī)，肝腎功能，記錄不良反應。 3.觀察結束后采用SPSS14.O軟件系統(tǒng)對結果進行分析。 二．觀察不同濃度涼血消湯含藥血清對HaCaT細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響 1、體外培養(yǎng)HaCaT細胞傳至第三代備用。當細胞融合80％以上時，加入0.25％胰酶消化，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育5min，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞變圓，細胞間連接

4、中斷，加入適量培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打瓶壁使細胞呈單細胞懸液，添加適量培養(yǎng)基吹打混勻，接種至96孔板備用。 2、大鼠灌胃制備鹽水，低、中、高劑量涼血消湯血清分別作用于HaCaT細胞。將24只大鼠隨機分為4組，空白對照組(生理鹽水)，涼血消疕湯低、中、高劑量組(0.5g/ml、1g/ml、2g/ml)，每組6只，雌雄各半。給藥組，每天灌胃給藥一次，連續(xù)7天；對照組，每天灌服等量生理鹽水。具體灌胃劑量按照《中醫(yī)科研設計與統(tǒng)計學》(湖

5、南科學技術出版社48實驗動物給藥方法52中藥血清藥理學方法)計算。末次灌胃1h后取血，分離血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3、采用MTT法觀察涼血消疕湯含藥血清對細胞增殖影響。調(diào)整細胞數(shù)至2×104的密度接種于96孔板，細胞70％-80％融合后棄去原培養(yǎng)液，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時后去上清，加入各組受試品，在酶標儀上測OD值。 4、運用ELISA法檢測上清液中VEGF的表達，調(diào)整細胞數(shù)至1×105接種于24孔板

6、，細胞70％-80％融合后棄去原培養(yǎng)液加入各組受試品，培養(yǎng)24小時后取上清按照人VEGF ELISA試劑盒(深圳晶美)步驟操作。 結果： 一.臨床觀察 根據(jù)PASI評分下降比值，治療組痊愈率7.69％，顯效率57.69％，總顯效率65.38％；對照組痊愈率5％，顯效率30％，總顯效率35％；治療組總顯效率高于對照組，經(jīng)統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療前，治療組患者PASI評分9.64±3.86，對

7、照組PASI評分9.58±2.48。治療后，治療組患者PSAI評分4.23±3.55，對照組患者PASI評分5.48±3.83，兩組患者治療后總評分比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，治療組優(yōu)于對照組。 二.實驗研究 1.抑制細胞增殖：各實驗組分別作用HaCaT細胞24小時后，HaCaT細胞組OD492為0.961±0.028，TGF-α刺激HaCaT細胞組OD492為1.163±0.073，生理鹽水大鼠血清組OD

8、492值為1.098±0.067，低、中、高含藥血清組OD492值分別為0.908±0.041、0.914±0.096、0.553±0.159，TGF-α刺激空白組OD492值明顯高于空白組OD492(P<0.05)隨藥物濃度梯度的升高，各含藥血清組細胞增殖活性逐漸降低，與鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各加藥組組間比較，低劑量組與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組與鹽水血清組，低、中劑量組比較差異均有顯

9、著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2.抑制VEGF分泌：各實驗組分別作用HaCaT細胞24小時后，VEGF表達量HaCaT細胞組OD450值為0.473±0.142，TGF-α刺激HaCaT細胞組OD450值為1.007±0.261，生理鹽水大鼠血清組OD450值為1.500±0.041，低、中、高含藥血清組OD450值分別為1.185±0.133、0.964±0.403、0.33±0.067，TGF-α刺激HaCaT細胞組OD4

10、50。 值與HaCaT細胞組OD450值比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，并且隨著藥物濃度梯度的升高，各含藥血清組VEGF分泌量逐漸降低，與鹽水組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，各加藥組組間比較差異亦有顯著統(tǒng)計學意義(P(0.01)。經(jīng)相關回歸分析顯示，VEGF表達量與呈高度負相關，r=-0.998，P<0.01。提示以上各涼血消湯含藥血清對HaCaT細胞VEGF分泌有明顯抑制作用，且具有濃度效應關系。