馬鈴薯甲蟲受體酪氨酸激酶基因Torso的分子克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)，是最大的一類酶聯(lián)受體，它既是酶也是受體。RTK與配體結(jié)合（主要是生長因子等），在細(xì)胞生長、增殖、分化和代謝等生物過程中起關(guān)鍵作用。所有的受體酪氨酸激酶都具有相似的分子結(jié)構(gòu)，由三部分組成:位于細(xì)胞外的配體結(jié)合域、由20個(gè)氨基酸組成的單次跨膜α螺旋和含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
　　本文基于馬鈴薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組和基因紐數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，獲得了

2、馬鈴薯甲蟲16條RTK基因的cDNA全長序列;構(gòu)建干擾載體dsLdTorso;通過RNA干擾技術(shù)探究LdTorso在蛻皮激素信號(hào)通路中的作用及沉默該基因?qū)τ紫x發(fā)育延遲、化蛹率及羽化的影響。
　　1、馬鈴薯甲蟲RTK基因的克隆及進(jìn)化分析
　　基于馬鈴薯甲蟲的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，鑒定出16個(gè)RTK基因。RT-PCR驗(yàn)證其正確性后，通過RACE克隆，獲得16個(gè)RTK基因的全長cDNA序列。這些基因編碼的蛋白都具有典型的受體酪氨酸激

3、酶組成特征。與赤擬谷盜、黑腹果蠅等其他物種進(jìn)化分析，這些基因編碼的蛋白主要包括表皮生長因子受體(EGFR)、促前胸腺激素受體(Torso)、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)、類胰島素生長因子受體(IGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)和神經(jīng)生長因子受體(NGFR)等類型。分別將16個(gè)RTK基因命名為LdHTL、LdPVR、LdOTK、LdCad96Ca、LdRET、LdDDR、LdALK、LdROR、LdROR2、LdDRL、

4、LdTorso、LdEGFR、LdInR1、LdInR2、LdSEV積LdEPHE。這16個(gè)RTK基因與赤擬谷盜的相關(guān)基因一一對(duì)應(yīng)，表明我們鑒定出了馬鈴薯甲蟲全部RTK基因。
　　2、馬鈴薯甲蟲LdTorso、MAPK(LdRas、LdRaf、 LdERK)的序列分析及時(shí)空表達(dá)
　　采用RACE技術(shù)，獲得Torso-MAPK途徑相關(guān)基因LdTorso、LdRas、LdRaf和LdERK全長cDNA序列。序列比對(duì)與系統(tǒng)樹分析結(jié)

5、果表明，這些基因進(jìn)化速率較慢，具有蛋白特異性的保守功能域。分析Torso-MAPK四個(gè)基因在不同發(fā)育期和不同組織中的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谂咛グl(fā)育早期都有較高的表達(dá)，而在胚胎后期降低。一齡到三齡幼蟲中，這四個(gè)基因在蛻皮出現(xiàn)前后高表達(dá)。在四齡幼蟲中LdTorso、 LdRas和LdERK在第一天和第四天高表達(dá)，而LdRaf在第三天高表達(dá)。Torso-MAPK四個(gè)基因在四齡初幼蟲的前胸腺、腦以及成蟲的精巢和卵巢均有較高的表達(dá)，此外，LdRas、

6、LdRaf和LdERK在腸道中表達(dá)量也較高。
　　3、沉默LdTorso基因?qū)τ紫x生長發(fā)育的影響
　　生測(cè)數(shù)據(jù)表明，喂食dsLdTorso不僅延遲了幼蟲的發(fā)育和蛹重的增加，而且影響化蛹和羽化。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，喂食dsLdTorso菌液顯著下調(diào)了試蟲LdTorso的表達(dá)量和MAPK信號(hào)通路LdRas、LdRaf和LdERK表達(dá)水平。沉默LdTorso基因后，參與蛻皮激素合成過程的重要基因LdPHM和LdDIB的表達(dá)水平顯