豬α干擾素的原核表達(dá)及重組桿狀病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、無菌采集健康豬的前腔靜脈血，分離培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，加入ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)后，提取總RNA，參照GenBank上豬a干擾素基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用RT-PCR克隆不含信號(hào)肽的豬α干擾素的基因片段，插入pGEM-T Easy載體中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌株，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件分析，獲得的基因片段大小為498bp，編碼166個(gè)成熟氨基酸，其核苷酸同源性與GenBank上登陸的豬α干擾素基因均在97.0％以上。

2、 用EcaRⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-pIFNα，回收目的基因片段，插入到原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建豬α干擾素原核表達(dá)載體pET32a-pIFN-α，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE)進(jìn)行豬α干擾素的表達(dá)，SDS-PAGE電泳圖譜中出現(xiàn)分子量大小40.2 kD的特異性條帶，同預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)過優(yōu)化IPTG的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，豬α干擾素的表達(dá)量明顯提高，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白量的20％。應(yīng)用鎳瓊脂糖凝膠樹脂層析柱吸附純化豬α干

3、擾素融合蛋白，不同濃度的咪唑緩沖液洗脫吸附蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定表明，400mM咪唑的緩沖液洗脫的豬α干擾素蛋白。純度最高，達(dá)到蛋白純化的預(yù)期目的，可以用于抗病毒活性試驗(yàn)。 純化后的豬α干擾素融合蛋白作用于鋪滿單層的豬肺巨噬細(xì)胞，24h后接種100TCID50豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)。設(shè)PRRSV感染的巨噬細(xì)胞為陽性對(duì)照，正常的巨噬細(xì)胞為陰性對(duì)照。間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PRRSV抗原，檢測(cè)結(jié)果顯示，陽性對(duì)照

4、，出現(xiàn)明顯的黃綠色熒光：豬a干擾素作用的巨噬細(xì)胞，在PRRSV感染后，無特異熒光；陰性對(duì)照，沒有出現(xiàn)特異熒光。 將克隆的豬α干擾素連接到供體載體pFastBac Dual中，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)過PCR、酶切和基因測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行篩選，構(gòu)建了重組供體載體pFastBac Dual-pIFN-α。重組供體載體pFastBac Dual-pIFN-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10 Bac，經(jīng)過卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、x-gal和IPTG的多重