泛素蛋白酶體途徑對(duì)高糖刺激的腎系膜細(xì)胞NF-κB-IκB信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病特有而常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，已成為西方國家引發(fā)終末期腎病(ESRD)的首要原因。DN的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，系膜細(xì)胞在DN發(fā)病過程中起著重要作用。在DN的發(fā)生發(fā)展中，氧化應(yīng)激、糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)等都可引起核因子-kB(NF-kB)的活化，活化的NF-kB致炎性細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子等明顯增多，從而引起腎臟間質(zhì)炎癥反應(yīng)和間質(zhì)纖維化，參與DN的發(fā)生，故NF-kB在D

2、N的發(fā)生和發(fā)展中有中樞調(diào)節(jié)作用。而泛素-蛋白酶體途徑(UPP)是細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白質(zhì)特異性降解的主要途徑。現(xiàn)已公認(rèn)NF-kB信號(hào)通路關(guān)鍵分子-IkB的降解受UPP調(diào)節(jié)。但糖尿病腎病時(shí)UPP與NF-kB/IkB信號(hào)通路間關(guān)系尚見文獻(xiàn)報(bào)道，故本研究用高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)，觀察泛素化蛋白及信號(hào)蛋白NF-kB、IkB-α的表達(dá)，并以蛋白酶體特異性抑制劑MG132作為阻斷劑，探討泛素蛋白酶體途徑對(duì)高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞NF-kB/I

3、kB信號(hào)通路的影響，為DN的防治提供新理論。 方法： 1．將體外培養(yǎng)的大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞株用5.6mmol/L(正常對(duì)照)、30mmol/L葡萄糖和不同濃度(0.5、1、2、3、4umol/L)的MG132處理各組細(xì)胞12～48小時(shí)，MTT法檢測(cè)高糖和不同濃度MG132對(duì)GMC增殖情況影響并繪制細(xì)胞生長曲線。 2．用不同濃度葡萄糖作為刺激因素，并用蛋白酶體抑制劑MG132作為阻斷劑作用于大鼠腎系膜細(xì)胞

4、，免疫印跡法檢測(cè)總NF-kB、IkB-α蛋白的表達(dá)及泛素化總蛋白的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光染色法及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組系膜細(xì)胞NF-kB的表達(dá)。 細(xì)胞分組為： ①正常對(duì)照組(葡萄糖濃度5.6mmol/L)； ②10mmol/L葡萄糖組； ③20mmol/L葡萄糖組； ④30mmol/L葡萄糖組、 ⑤甘露醇組(24.4mmol/L甘露醇作為滲透壓對(duì)照)、； ⑥5.6mmol/L葡萄糖加

5、MG132(1 μmol/L)組； ⑦20mmol/L葡萄糖糖加MG132(1 μmol/L)組； ⑧30mmol/L葡萄糖加MG132(1 μmol/L)組。 結(jié)果： ①在培養(yǎng)48h以內(nèi)，低濃度MG132(≤1μmol/L)和30mmol/L的高糖對(duì)GMC生長無明顯影響；MG132濃度>1umol/L時(shí)，隨著濃度的增加，MG132對(duì)GMC抑制作用增強(qiáng)。 ②與對(duì)照組相比，20mmol/L、30mm

6、ol/L葡萄糖作用12h和10mmol/L葡萄糖對(duì)GMC內(nèi)IkB-α蛋白的表達(dá)無明顯影響；20mmol/L和30mmol/L葡萄糖作用GMC24h～48h后IkB-α蛋白的表達(dá)明顯下降(p<0.01)，且具有時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)。與高糖組比較，高糖組加入MG132后，系膜細(xì)胞IkB-α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。 ③免疫印跡法顯示GMC中總NF-kBp65蛋白表達(dá)在不同濃度葡萄糖組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)；但細(xì)胞免

7、疫熒光染色法及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示：高糖作用的GMC胞核中NF-kBp65表達(dá)明顯增加(P<0.01)，具有時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)。高糖組加入MG132后，GMC胞核中NF-kBp65表達(dá)被明顯抑制(P<0.01)。④高糖可促進(jìn)GMC泛素化蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)，高糖對(duì)促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞泛素化蛋白表達(dá)增加作用具有時(shí)間、濃度依賴效應(yīng)。 結(jié)論： ①.高糖可促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞總泛素化蛋白表達(dá)增加，IκB-α蛋白泛素