初級傳入神經(jīng)元激活對周圍神經(jīng)元和非神經(jīng)元的信號調(diào)制.pdf

1、第一部分
　　 雖然神經(jīng)元之間最主要的通訊方式是化學突觸，但是電突觸和非突觸性化學傳遞也占據(jù)著重要地位?？稍诒掣窠?jīng)節(jié)(dosal root ganglion，DRG)內(nèi)的初級神經(jīng)元之間因為衛(wèi)星細胞的分隔，即缺少化學突觸也無電突觸，而大量的研究發(fā)現(xiàn)卻表明節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細胞間能相互影響，即刺激誘導一個神經(jīng)細胞興奮，另一個鄰近的細胞也被動發(fā)生興奮性改變，這種現(xiàn)象被命名為“交叉興奮”(cross excitation)，而產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機

2、制還只是在猜測之中。以視神經(jīng)節(jié)為材料的研究又發(fā)現(xiàn)，節(jié)內(nèi)神經(jīng)細胞興奮釋放的活性物質(zhì)通過它相應的受體能誘導細胞間通訊，然而對這種胞間通訊模式機制的確定，以及在其他節(jié)內(nèi)神經(jīng)細胞間尋找更多的支持顯得非常必要。在本研究中，我們在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元間發(fā)現(xiàn)了一個由ATP介導的非突觸性化學傳遞模式。單個DRG神經(jīng)元持續(xù)去極化激起這個細胞的胞內(nèi)鈣振蕩性升高，持續(xù)性的鈉離子內(nèi)流，以及接下來細胞體的ATP釋放并向周圍擴散最終誘發(fā)鄰近未受刺激的被動細胞內(nèi)規(guī)則的

3、鈣振蕩。
　　 鈣振蕩和鈉離子內(nèi)流均能被TTX抑制，但不受細胞外鈣離子濃度的影響，且在無鈣溶液中仍能發(fā)生，表明鈉離子內(nèi)流介導的細胞膜去極化以及胞內(nèi)鈣釋放是鈣振蕩產(chǎn)生的原因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鈣振蕩產(chǎn)生的源在IP3受體引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的鈣釋放，而不由ryanodine受體介導。采用ATP實時成像跟蹤了ATP的釋放和擴散，且ATP水解酶徹底瓦解鈣振蕩擴散，說明神經(jīng)激活釋放了化學物質(zhì)ATP，它們在DRG神經(jīng)元間擔當著傳遞信使。我們又發(fā)現(xiàn)

4、非選擇性P2Y受體抑制劑蘇拉明、PLC 抑制劑U73122、以及IP3受體拮抗劑2-APB能抑制鈣振蕩傳播，這就表明了介導ATP傳播作用的受體途徑。為了更充分地描述ATP在這一現(xiàn)象中的作用，外源性ATP被應用到DRG細胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)不同濃度的ATP通過P2Y受體在DRG神經(jīng)元不是引起一過性鈣升高，就是誘發(fā)鈣振蕩，10μM—100μM的ATP激起一過性鈣升高，100μM—250μM的ATP誘發(fā)鈣振蕩。因此，根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們總結(jié)持續(xù)去極化

5、刺激引起細胞內(nèi)鈣振蕩性釋放和ATP釋放，胞內(nèi)鈣升高是ATP釋放的先決條件，接著釋放的ATP通過它的代謝性受體引發(fā)了下一個細胞的鈣振蕩，完成它的傳播作用。這是一種特殊的通訊形式，可能是DRG神經(jīng)元間電興奮性胞間傳遞的分子基礎。
　　 第二部分
　　 成纖維細胞是非興奮性細胞，它們高度表達縫隙連接蛋白并形成縫隙連接通訊進行著離子、分子的交流，除了同種細胞間形成廣泛的三維結(jié)構(gòu)外，成纖維細胞還與其他類型的細胞形成縫隙連接，比如內(nèi)

6、皮細胞、肥大細胞、神經(jīng)細胞等?？p隙連接通訊在成纖維細胞參與的生理和病理過程中起著重要作用，例如參與發(fā)育、創(chuàng)傷修復、炎癥等過程。在此研究中我們發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元和真皮成纖維細胞共培養(yǎng)體系中，神經(jīng)元活動能抑制成纖維細胞的縫隙連接通訊，它的抑制作用與NMDA 谷氨酸受體興奮以及由它們介導細胞內(nèi)鈣離子升高有關(guān)。在共培養(yǎng)的DRG 神經(jīng)元和成纖維細胞樣品中，去極化電刺激誘導神經(jīng)元興奮后，檢測成纖維細胞的染料偶聯(lián)率，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的染料偶聯(lián)細胞數(shù)目減

7、少；并且未受到刺激的共培養(yǎng)體系中成纖維細胞染料偶聯(lián)率也比單純成纖維細胞培養(yǎng)的染料偶聯(lián)率低，這種情況發(fā)生在共培養(yǎng)5-6天后；膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元自動發(fā)放動作電位和TTX 敏感的鈉電流；免疫化學檢測發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中成纖維細胞最主要的連接蛋白CX43 表達減少，可能與連接通訊效率降低有關(guān)。但是立即檢測給予去極化電刺激的樣品中成纖維細胞的主要連接蛋白CX43，發(fā)現(xiàn)盡管染料偶聯(lián)率減少，CX43 表達并不減少，考慮縫隙連接通訊效能降低可能

8、還有主要其他機制，進一步研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸受體抑制劑MK-801 能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元在縫隙連接通訊上的作用，而且NMDA 受體主要介導鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣升高已經(jīng)被認為能抑制縫隙連接通訊；接著我們發(fā)現(xiàn)NMDA 受體和CX43 共表達于成纖維細胞膜上，外源性谷氨酸應用能強有力地升高成纖維細胞內(nèi)鈣濃度，并且降低成纖維細胞縫隙連接通訊，這部分作用能被NMDA 受體抑制劑MK-801 逆轉(zhuǎn)。我們還發(fā)現(xiàn)將共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)基用于單純成纖維細胞培養(yǎng)，也導致他

9、們的縫隙連接通訊下降。根據(jù)這些觀察我們總結(jié)去極化刺激導致的神經(jīng)元激活或者神經(jīng)元自發(fā)活動能釋放谷氨酸，通過興奮NMDA 受體，升高細胞內(nèi)鈣抑制成纖維細胞的縫隙連接通訊。因此我們認為除了已經(jīng)被證明的成纖維細胞對神經(jīng)元的生長和發(fā)育進行調(diào)節(jié)外，神經(jīng)元活動也通過其釋放的遞質(zhì)對成纖維細胞的通訊功能進行調(diào)節(jié)。
　　 第三部分
　　 最近幾年，小動物的整體成像已經(jīng)逐漸發(fā)展為一個探測發(fā)生在活體動物細胞和分子水平生命活動的強有力的研究工具。

10、在這個研究中，我們用一套整體熒光成像系統(tǒng)，在體檢測裸鼠體內(nèi)可能有的電針效應表達。根據(jù)比較動物學研究中在小動物身上確定的幾個穴位點，我們嘗試在這些穴位點注射低分子量能透過縫隙鏈接的熒光染料5,6-carboxyfluorescein和Lucifer yellow 以及不能透過縫隙連接的大分子量熒光染料rhodamine dextran，然后進行一系列掃描跟蹤熒光染料的擴散，測量它們擴散的速度和范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針能顯著誘導低分子熒光染料循著