腦源性神經營養(yǎng)因子對水牛卵母細胞體外成熟的影響及其作用機制的初步研究.pdf

1、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)是神經營養(yǎng)因子家族成員，不僅在神經系統(tǒng)廣泛表達，在哺乳動物的卵巢中也表達。研究表明，BDNF對哺乳動物卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育起重要作用。本研究旨在探討B(tài)DNF對水牛卵母細胞體外成熟的影響，并對其相關作用機制進行初步研究，以期進一步優(yōu)化卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系，提高胚胎體外生產的效率。
　　1.水牛BDNF基因克隆、序列分析及其在不同組織中的表達模式。測序結果顯示，克隆獲得的水牛BDNF基

2、因全長800bp，編碼區(qū)753bp，編碼250個氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與多個物種的同源性都很高;蛋白結構預測分析顯示，BDNF定位在細胞內且為含有信號肽序列的分泌型蛋白，其三級結構由多個α-螺旋、3對反向平行的β-折疊結構等構成活性中心，即NGF功能結構域;qRT-PCR檢測結果顯示，BDNF在胎兒及成年水牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、皮膚、肌肉、卵巢、睪丸10種組織中均有表達，在卵巢上高表達;受體TrkB、p75在胎兒

3、及成年水牛各組織中的表達模式與BDNF并不完全一致，但TrkB在卵巢中高表達，而p75在卵巢中表達很低。
　　2.BDNF及其受體在水牛卵泡、卵母細胞及早期胚胎中的表達模式。利用免疫組化、ELISA、免疫熒光染色及qRT-PCR等方法的檢測結果發(fā)現(xiàn)，BDNF在水牛卵泡發(fā)育各時期均有表達，且主要在卵母細胞、顆粒細胞及卵丘細胞中表達，同時在直徑4＜Φ≤7mm的卵泡中，卵泡液BDNF濃度、卵泡顆粒細胞BDNF mRNA及TrkB mRN

4、A的表達水平均最高，Φ＞7mm的次之，2≤Φ≤4mm的最低，且存在顯著性差異(P＜0.05)，而p75 mRNA表達水平很低;水牛COCs在體外成熟過程中(0h、6h、12h、24 h)，BDNFmRNA在卵母細胞及卵丘細胞上表達呈逐漸上升趨勢，TrkB mRNA在卵丘細胞上表達呈先上升后下降趨勢，但在卵母細胞上不表達，p75 mRNA在卵母細胞及卵丘細胞上表達呈先降低后快速上升趨勢;水牛早期胚胎在發(fā)育過程中（2cell、4cell、8

5、cell、桑椹胚、囊胚），BDNF mRNA表達呈先上升后下降趨勢，4cell表達最高，p75 mRNA表達呈逐漸下降趨勢，2cell表達最高，BDNF及p75在桑椹胚及囊胚表達都很低，而TrkB在胚胎發(fā)育過程中不表達。
　　3.BDNF對水牛卵母細胞體外成熟的影響及其作用機制。在體外成熟液中添加10ng/ml的BDNF能顯著提高卵母細胞的成熟率(59.07％ vs48.96％，P＜0.05)及隨后IVF早期胚胎的囊胚率（23.2

6、9％ vs15.58％，P＜0.05），但對裸卵成熟無顯著影響（50.82％ vs50.86％，P＞0.05）;在體外成熟液中分別添加TrkB和p75的抑制劑K-252a與Pep-5，BDNF+K-252a組的成熟率顯著低于BDNF組(49.50％ vs60.01％，P＜0.05)，而BDNF+Pep5組的成熟率與BDNF組相比無顯著性差異（59.04％ vs60.01％，P＞0.05）;卵丘細胞凋亡相關基因(Bax、Bcl-2、Cas

7、pase-3、Caspase-9、Fas、p53)、BDNF受體(TrkB、p75)及發(fā)育相關基因(CCNB1、COX2、Cx37、Cx43、CYP11A1、FSHR、HAS2、MAPK、PCNA、PGES、PTX3、TSG-6）表達的qRT-PCR檢測結果顯示，BDNF能顯著下調Caspase-9、Fas的表達，上調TrkB、CCNB1、PCNA、Cx37、Cx43、HAS2、PTX3、TSG-6的表達。
　　以上結果表明:(1

8、)克隆獲得的水牛BDNF基因全長800bp，編碼區(qū)753bp，編碼250個氨基酸，在物種間具有高度保守性，且BDNF及其受體TrkB在水牛卵巢中高表達;(2) BDNF在水牛卵泡發(fā)育各時期及不同直徑卵泡的卵泡液中均有表達，同時BDNF及p75在不同直徑的卵泡顆粒細胞、體外成熟過程中的卵母細胞和卵丘細胞、以及早期發(fā)育階段的胚胎中均有表達，而TrkB僅在顆粒細胞和卵丘細胞中高表達，在卵母細胞及早期胚胎中不表達;(3)適宜濃度的BDNF(10