玻璃體腔注射鼠神經(jīng)生長因子治療視網(wǎng)膜色素變性的臨床前研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）是一類以進行性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡為特征的致盲性疾病。臨床分為典型及非典型兩類。在亞洲人中常見的RP類型為典型RP和非典型RP中的結(jié)晶樣視網(wǎng)膜色素變性（Bietti’s crystalline dystrophy，BCD）2.尚無有效臨床治療方法。目前對RP治療的研究熱點包括基因治療，營養(yǎng)因子補充、干細(xì)胞移植及視覺假體植入，其中外源性營養(yǎng)因子攝入，相對簡捷、安全且可以和其他治

2、療方法聯(lián)合應(yīng)用，是可行性較強并具有較好研究前景的治療方法。此外，臨床研究需要靠靈敏的檢測指標(biāo)來評估療效，但目前對BCD的研究多限于基因突變的篩選以及臨床表現(xiàn)的個案報道。缺乏對BCD疾病進展程度，特別是視覺功能損害程度的客觀評價標(biāo)準(zhǔn)。
　　神經(jīng)生長因子（NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中研究最為透徹的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。研究表明NGF的減少或缺乏與RP疾病的發(fā)生發(fā)展存在重要的關(guān)系3-5。眼局部補充外源性NGF能夠明顯延緩視網(wǎng)膜色素變

3、性動物模型中感光細(xì)胞的變性5。
　　從小鼠頜下腺提取的NGF的肌肉注射劑型作為國家準(zhǔn)字號藥物進入臨床應(yīng)用為NGF治療視網(wǎng)膜變性疾病帶來了契機。但由于全身給藥非目標(biāo)性及達眼部藥物濃度的有限性，使其應(yīng)用受到一定限制。以往對研究者多采用球周注射NGF來研究其對RP的治療作用，需要較高的藥物濃度及頻繁的重復(fù)注射。玻璃體腔注射技術(shù)具有眼內(nèi)直接給藥的優(yōu)勢，但玻璃體腔注射NGF在眼內(nèi)各組織特別是視網(wǎng)膜的藥物分布情況尚未見報道。研究證明玻璃體腔注

4、射NGF能夠延緩缺血、視網(wǎng)膜脫離等導(dǎo)致的繼發(fā)性視網(wǎng)膜變性6,7，但并沒有報道玻璃體腔注射NGF對所研究動物模型的眼部安全性。而且尚無玻璃體腔注射NGF治療RP的基礎(chǔ)研究報道。本實驗室前期工作證實了20ug/0.1mlNGF進行玻璃體腔注射對家兔及晚期典型RP患者的安全性，但單次注射NGF對晚期RP患者并沒有明顯的有效性。其原因可能是藥物含量低，注射頻率少，納入晚期RP病人視網(wǎng)膜損害嚴(yán)重。因此本研究需要進一步增加NGF藥物劑量，探索重復(fù)注

5、射NGF策略，擴大納入RP受試者的分期及分類范圍，來深入進行玻璃體腔注射NGF的臨床前研究。
　　臨床研究需要依靠靈敏的檢測指標(biāo)來進行療效的評估，但目前對BCD的研究多限于基因突變的篩選以及臨床表現(xiàn)的個案報道。缺乏對BCD疾病進展程度，特別是視覺功能損害程度的客觀評價標(biāo)準(zhǔn)。因此明確臨床視覺功能檢查手段如視力、視野、電生理檢查等對各臨床分期BCD視網(wǎng)膜功能評價的作用是進行治療學(xué)研究的前提。瞳孔光反射（PLR)是一種對視覺反應(yīng)的重要客

6、觀檢查手段8,9。劉勇博士前期研究中證實特定光刺激下瞳孔收縮強度能夠客觀、靈敏反應(yīng)典型RP感光細(xì)胞功能。但瞳孔收縮強度能否客觀量化評估包括晚期在內(nèi)的BCD病人感光細(xì)胞功能，尚未見系統(tǒng)研究。
　　因此本研究擬應(yīng)用較高劑量NGF，通過動物試驗明確玻璃體腔注射NGF后眼內(nèi)藥物含量分布、藥物對眼部安全性及對RCS大鼠有效性，進而評估單次和重復(fù)玻璃體腔注射NGF治療典型RP及BCD受試者的安全性，在此基礎(chǔ)上進行玻璃體腔注射NGF對RP受試者

7、有效性的研究，為RP的治療探索新的藥物及使用方法。
　　本試驗方案獲第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過（審批號：KY2008001），并在世界衛(wèi)生組織臨床試驗注冊分部中國臨床試驗注冊中心成功注冊，（注冊號：ChiCTR-TRC-00000411）。試驗內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1、動物研究部分：
　　1）采用同位素示蹤法對比研究家兔玻璃體腔注射和球周注射125I-NGF眼部各組織藥物分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射N

8、GF較球周注射能夠在眼內(nèi)各組織達到高的藥物濃度。玻璃體腔注射125I-NGF后，眼部各組織125I-NGF含量分布為玻璃體（471.75±4.42）＞視網(wǎng)膜（118.32±18.74）＞脈絡(luò)膜（79.13±8.82）＞虹膜睫狀體（68.29±14.41）＞房水（51.42±7.28）＞鞏膜（36.64±4.16）＞角膜（21.00±3.10）。
　　2）進行兔眼玻璃體腔注射NGF的眼部安全性評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時間點觀察其角膜、晶體

9、、玻璃體、視網(wǎng)膜均未見明顯異常，1m時行組織病理檢查視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)未見異常。
　　3）采用DAPI染色視網(wǎng)膜外核層厚度測量以及TUNEL試驗檢測視網(wǎng)膜外核層感光細(xì)胞凋亡指數(shù)的方法評估P30d RCS大鼠重復(fù)玻璃體腔注射NGF的有效性。結(jié)果顯示在P45d，P60d，P90d時，重復(fù)玻璃體腔注射NGF組其視網(wǎng)膜外核層厚度厚于生理鹽水注射組及空白對照組（P＜0.05）；NGF治療組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡指數(shù)低于生理鹽水注射組及空白對照組（P

10、＜0.05）。
　　2、進行了單次玻璃體腔注射NGF對20例典型RP及15例BCD安全性的臨床前試驗。發(fā)現(xiàn)NGF治療后1d、7d、1m時BCD主觀感覺好于典型RP。典型RP治療后眼部炎癥反應(yīng)明顯，1d時評分大于3分占30％，7d時占10％，1m炎癥消失；BCD治療后眼部炎癥反應(yīng)輕，1d時評分大于3分占10％，7d時炎癥已經(jīng)消失。長期觀察（12m）典型RP及BCD眼部B超、眼底及OCT未見明顯異常。不良反應(yīng)發(fā)生率：典型RP為20％，

11、BCD為0.基于此結(jié)果進一步進行了重復(fù)玻璃體腔注射NGF對BCD安全性的臨床前試驗，對每3月重復(fù)注射NGF及每1月重復(fù)注射NGF的安全性進行比較。發(fā)現(xiàn)兩組BCD受試者均主觀感覺良好，眼部炎癥反應(yīng)輕，無炎癥疊加現(xiàn)象，長期觀察兩組BCD OCT均未見明顯異常。
　　3、通過眼底分期及視覺功能檢測對15例BCD受試者病情進展程度進行治療前評估，同時篩選對BCD有效的視覺功能檢測指標(biāo)。1例早期BCD85°視野檢查為1級、fERG五項檢查為

12、B級，mERG已顯示出明顯異常。8例中期BCD fERG、85°視野檢查存在多個分級階段的異常程度。mERG為熄滅型。6例晚期BCD85°視野尚可定位殘存視敏度較弱的視島，但fERG、mERG均為熄滅型。采用自主研制的全視野光刺激瞳孔記錄儀對BCD受試者進行PLR檢測，發(fā)現(xiàn)BCD受試者瞳孔收縮強度均普遍低于正常人，且隨BCD分期進展，瞳孔收縮強度降低。低亮度藍光刺激下，瞳孔收縮強度隨病情分期變化明顯，中等亮度白光刺激下瞳孔收縮強度與fE

13、RG max-b波振幅呈正相關(guān)。提示暗適應(yīng)全視野刺激下的瞳孔收縮強度可以作為BCD患者感光細(xì)胞功能的客觀量化指標(biāo)。
　　4．對15例BCD受試者進行了每1月及每3月重復(fù)玻璃體腔注射NGF療效對比的臨床前試驗。結(jié)果表明：經(jīng)玻璃體腔注射后1月受試者視力，視野，藍光、白光刺激下瞳孔收縮強度均有所提高。經(jīng)重復(fù)玻璃體腔注射NGF后，每1月重復(fù)治療組視力，視野，藍光、白光刺激下瞳孔收縮強度均能夠維持首次治療后的視覺改善狀態(tài)，而每3月重復(fù)治療組

14、則有所波動，在每次治療后3月時有回復(fù)的趨勢。停藥后兩組視功能均有回退的傾向。
　　綜上所述，本研究得到如下結(jié)論：
　　1、玻璃體腔注射NGF在兔眼各組織內(nèi)特別是視網(wǎng)膜組織可達到高藥物含量，這一治療方法對兔眼是安全的，證明了玻璃體腔注射NGF是一種理想的治療眼底疾病方法。
　　2、重復(fù)玻璃體腔注射NGF能延緩RCS大鼠ONL層變性，為NGF治療RP的臨床研究提供了重要的基礎(chǔ)試驗依據(jù)。
　　3、通過臨床研究證實了玻璃