大菱鲆紅體病虹彩病毒主要衣殼蛋白與宿主蛋白的相互作用研究.pdf

1、大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是我國養(yǎng)殖大菱鲆病毒性疾病的主要病原之一，TRBIV主要衣殼蛋白(Major Capsid Protein,MCP)是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白。本研究運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選與TRBIV MCP相互作用的大菱鲆脾細(xì)胞蛋白，從而揭示虹彩病毒感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制，為魚類虹彩病毒的致病機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。 首先，構(gòu)建了用于酵母雙雜交的誘餌質(zhì)粒p

2、DEST32-MCP。采用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning kit構(gòu)建了pENTR-MCP質(zhì)粒；pENTR-MCP與載體pDEST32應(yīng)用Gateway重組反應(yīng)得到pDEST32-MCP質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定確定重組子。 利用CloneMiner.cDNA Library Construction Kit構(gòu)建了大菱鲆(Scophthalmusmaxims)脾細(xì)胞cDNA文庫。從大菱

3、鲆脾細(xì)胞中提取總RNA，再分離純化出mRNA。逆轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，繼而合成了雙鏈平末端cDNA。經(jīng)純化定量后，應(yīng)用GatewayBP技術(shù)同源重組，得到pDONR222-cDNA，從而獲得大菱鲆脾細(xì)胞cDNA文庫。經(jīng)測定擴(kuò)增后文庫滴度為2.52×107cfu/ml，插入片段大部分分布在500-1000bp之間，平均大小約為787.6bp，可用作酵母雙雜交的篩選文庫。 將pDEST32-MCP轉(zhuǎn)入酵母菌株MaV203，通過自激

4、活檢測確定3AT濃度。pDONR222-cDNA通過Gateway LR重組反應(yīng)與pDEST22載體連接，得到pDEST22-cDNA并轉(zhuǎn)化入含有pDEST32-MCP的酵母菌株MaV203，分別在選擇性平板上篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)序列測定p22大小為1117bp，p23大小為891bp，p31大小為491bp，p31與p23部分重合。分析結(jié)果表明，p23與60s核糖蛋白L23有很高的同源性，相似度達(dá)100％；p22無較大范圍內(nèi)的同源