長毛兔白細(xì)胞介素-4（IL-4）基因克隆及真核表達(dá).pdf

1、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4；IL-4)是由活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能重要的細(xì)胞因子。兔白細(xì)胞介素-4是兔免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中具有重要功能的細(xì)胞因子，尤其是在兔的體液免疫中起非常重要的作用。 1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，在國內(nèi)首次從ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的長毛兔外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到IL-4基因，并將其克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)菌落PCR、酶切分析、序列測定鑒定及序列分

2、析，克隆得到的IL-4基因(序列號(hào)：EF606761)的開放閱讀框含有444個(gè)核苷酸，編碼147個(gè)氨基酸，其中前24個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽，成熟肽含123個(gè)氨基酸殘基。與Genbank中已登錄的歐洲兔IL-4基因(序列號(hào)：AF169169)的核苷酸序列和推知氨基酸序列同源性均為100％；與其他哺乳動(dòng)物如犬、貓、人、豬、牛、羊、馬、大熊貓和鼠等的核苷酸同源性在57.0％(大熊貓)～69.8％(人)之間；編碼氨基酸同源性在43.0％(鼠)～53

3、.6％(人)之間。構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果都表明，兔與人的親緣關(guān)系相對(duì)較近，與鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 2.應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將克隆的長毛兔IL-4基因克隆到真核表達(dá)載體上pCDNA3.1(+)，通過菌落PCR的方法在轉(zhuǎn)化子中篩選陽性克隆，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切初步鑒定和序列測定進(jìn)行了鑒定，結(jié)果證實(shí)真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)IL-4成功構(gòu)建。 3.將構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/IL-4轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞

4、(COS7細(xì)胞株)，RT-PCR檢測IL-4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；用兔淋巴母細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測其在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物對(duì)兔淋巴細(xì)胞的刺激活性。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞株后，RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA中含有IL-4對(duì)應(yīng)的mRNA；兔淋巴母細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染后，表達(dá)的重組蛋白能夠促兔外周淋巴細(xì)胞增殖作用，具有一定的生物學(xué)活性。 本研究首次成功克隆了長毛兔IL--4基因，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了真核表達(dá)。本研究成果為了解各