電刺激小腦頂核對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-Ischemic Brain Damage,HIBD)是指由于圍生期的窒息缺氧所導(dǎo)致的腦損傷,輕癥者預(yù)后良好,中重癥者常遺留視聽(tīng)障礙、智力障礙、腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,是導(dǎo)致兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因,但目前尚無(wú)有效的治療方法,給整個(gè)社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此,尋找治療新生兒HIBD及降低其后遺癥發(fā)生率的有效方法成為醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(neuroglial

2、cell)是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,AS)作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種類型,在數(shù)量上占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì),約為神經(jīng)元的10～50倍,星形膠質(zhì)細(xì)胞一度被認(rèn)為是大腦的填充物,對(duì)神經(jīng)元僅起營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)和絕緣的作用,在神經(jīng)系統(tǒng)中擔(dān)任著次要的、被動(dòng)的角色。近年來(lái)人們對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了較為廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)組織修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫及突觸傳遞等方面都起著十分重要的作用,使

3、我們對(duì)其有了重新的認(rèn)識(shí)。
　　 目的：電刺激小腦頂核(fastigial nucleus electrical stimulation,FNS)作為一種促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的物理療法拓展了腦損傷治療的新途經(jīng),而且采用仿生物電技術(shù),模擬實(shí)驗(yàn)性FNS而研制的小腦電刺激儀,已廣泛應(yīng)用于成人腦缺血疾病的治療并取得了較滿意的療效。目前關(guān)于FNS對(duì)新生兒HIBD的研究多集中于神經(jīng)元上,對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的研究尚少,基于星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要

4、作用,本實(shí)驗(yàn)在建立HIBD新生大鼠模型的基礎(chǔ)上,電刺激小腦頂核,通過(guò)觀察大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化、檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein,GFAP)表達(dá)的變化來(lái)探討電刺激小腦頂核對(duì)新生兒HIBD的腦保護(hù)作用。
　　 材料與方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及HIBD模型的制備新生7日齡健康清潔級(jí)SD大鼠180只,雌雄不限,體重13-16g,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組

5、和電刺激組,每組各60只,各組于制模術(shù)后又按3天、7天、14天、21天隨機(jī)分為4組,每組各15只。采用改良的的RICE法:以新生7日齡SD大鼠為研究對(duì)象,乙醚吸入麻醉后,分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈后,遂置于缺氧箱中,持續(xù)充以氣流量為2L·min-1的92:8氮氧混合氣體2小時(shí),大鼠出現(xiàn)左旋夾尾者則證明模型制備成功,可納入實(shí)驗(yàn)。
　　 2.電刺激干預(yù)
　　 電刺激組大鼠于術(shù)后第2天開(kāi)始給予電刺激治療,電刺激大鼠耳后部小腦頂核(

6、相當(dāng)于人體的雙側(cè)乳突部),30分鐘／次,1次／天,電刺激強(qiáng)度為3.5V、頻率50HZ,使大鼠肢體稍有震顫為宜。假手術(shù)組及模型組大鼠不予電刺激治療,相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)僅予抓捕固定。
　　 3.標(biāo)本采集與制備各組分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天隨機(jī)取5只大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后,剪開(kāi)胸腔暴露心臟,剪開(kāi)右心耳建立循環(huán)通道,先以生理鹽水快速灌注沖洗至右心耳流出澄清液體,隨即換用40g／L多聚甲醛-5g／L戊二醛混合液內(nèi)固定,沿頸部斷頭后迅速取左

7、海馬切成1mm×1mm×1mm大小,遂將其置于40g／L戊二醛溶液中固定保存,應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。其余大鼠于同樣的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)乙醚吸入麻醉后,心臟灌注40g／L多聚甲醛固定腦組織,斷頭取腦,做冠狀切片,應(yīng)用HE染色觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變,免疫組化檢測(cè)大鼠海馬區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。
　　 4.腦組織海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)將電鏡樣本經(jīng)PBS液沖洗后,放入1％鋨酸中后固定,經(jīng)脫水、

8、包埋、聚合、50nm超薄切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后,應(yīng)用日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 5.腦組織海馬區(qū)HE染色及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)光鏡下觀察大鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化。
　　 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色,用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量切片海馬區(qū)GFAP積分光密度值,每張切片取5個(gè)視野測(cè)量,取其平均積分光密度值。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,多組均數(shù)比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn),以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)模型組大鼠腦組織海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)水腫,線粒體大部分嵴和膜融合,游離核糖體減少,核異染色質(zhì)增加,邊集于核膜下,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同程度脫顆粒；電刺激組大鼠海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹減

10、輕,胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富,包括線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體,核膜清晰。
　　 2.大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,形態(tài)正常,胞質(zhì)豐富,胞漿染色均勻,細(xì)胞核清楚,核仁明顯；模型組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)明顯的壞死灶,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,部分神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小為三角形,核濃縮深染,核仁消失。電刺激組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列有序,變性壞死較少,多數(shù)細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常,細(xì)胞核清楚。
　　 3.膠質(zhì)纖維酸

11、性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)方法染色模型組及電刺激組大鼠3天時(shí)GFAP的平均積分光密度值與假手術(shù)組比較即有升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),7天、14天、21天時(shí)GFAP的平均積分光密度值仍較假手術(shù)組高,且在7天時(shí)達(dá)到高峰,電刺激組GFAP的平均積分光密度值在各時(shí)間點(diǎn)均較模型組同時(shí)間點(diǎn)低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)電刺激小腦頂核可減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性損傷。
　　 (2)電刺