根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化對煙曲霉chsC基因的功能研究.pdf

1、研究背景和目的： 煙曲霉是引起過敏性支氣管肺曲霉病、曲霉球和侵襲性曲霉病的空氣播散性的條件致病真菌。在免疫抑制患者中，導(dǎo)致致死性感染的重要原因是由于吸入煙曲霉分生孢子進而發(fā)展為侵襲性曲霉病。由于癌癥、器官移植和其它原因造成免疫抑制患者逐漸增多，侵襲性曲霉病的發(fā)病率也逐年增加。盡管進行了積極的抗真菌治療，侵襲性曲霉病的病死率仍維持在一個較高的水平。如何預(yù)防和治療這一類疾病是個突出而且亟待解決的問題。很多分子和基因與煙曲霉的毒力相關(guān)

2、。但是，對于侵襲性曲霉病具體是哪一個毒力因子起主導(dǎo)作用目前仍然不是很清楚。幾丁質(zhì)是煙曲霉細胞壁上第三大類多糖化合物并且有多種幾丁質(zhì)合成酶被檢測到。煙曲霉chs基因家族至少包括7種不同的基因，分別為chsA(組Ⅰ)、chsB(組Ⅱ)、chsC(組Ⅲ)、chsD(組Ⅵ)、chsE(組Ⅴ)、chsF(組Ⅳ)和chsG(組Ⅲ)。這些基因?qū)熐沟谋硇秃投玖Φ母淖兤鹬匾饔?。chsE一突變株能夠減少菌絲體和所有菌絲上幾丁質(zhì)的水平，也能減少分生孢

3、子的受精作用；chsG-突變株顯示幾丁質(zhì)合成酶活性的降低，減少菌群的生長半徑和高端菌絲生長，揭示這種酶在菌絲頂端發(fā)揮作用；chsE-/chsG-雙重突變對煙曲霉并不是致命的，它降低了幾丁質(zhì)合成酶的活性，其克隆的生長速度也明顯減慢，此雙重突變體能夠產(chǎn)生更多的分枝菌絲。但是煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶chsC在其生長方式、形態(tài)及對抗真菌藥物的敏感性方面的作用仍然不是十分清楚。 目前，煙曲霉全基因組測序已經(jīng)完成，通過反向或正向遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體

4、是一個有效的研究煙曲霉未知基因功能的方法。用原生質(zhì)體通過同源重組來打斷基因的方法曾經(jīng)被廣泛運用，但此方法費時、費力，而且其同源重組的頻率也比較低。電穿孔和其它一些生物學(xué)的方法也經(jīng)常被應(yīng)用到煙曲霉的轉(zhuǎn)化中，但是這些方法都存在多拷貝插入和低同源重組等缺點。作為一種替代方法，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(ATMT)已經(jīng)在多種曲霉的轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。本研究將把根癌農(nóng)桿菌作為工程菌應(yīng)用于插入突變煙曲霉的轉(zhuǎn)化中，構(gòu)建出煙曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因缺失突變體，從而對煙

5、曲霉幾丁質(zhì)合成酶基因在煙曲霉的生活方式、表型以及抗真菌藥物敏感性方面的作用作一探討。同時作為對ATMT這一新方法的探討，我們觀察了ATMT轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件。 方法與結(jié)果： 1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的二元載體的構(gòu)建及鑒定 高保真擴增幾丁質(zhì)合成酶chsC基因兩端約500bp的片段，分別插入質(zhì)粒pPK2中潮霉素抗性序列的兩側(cè)，將構(gòu)建好的的質(zhì)粒命名為pPK2/chsC-::hph。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/SacⅠ進行雙酶切

6、，把切下來約5.5kb的片段與用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/SacⅠ進行雙酶切的pDHt/SK大片段相連接，構(gòu)建出的二元載體pDHt/chsC-:：hph用于ATMT。二元載體用HindⅢ/SacⅠ進行雙酶切鑒定，載體切出兩條條帶，一條為5.5kb包含潮霉素抗性基因、構(gòu)巢曲霉啟動子以及兩側(cè)的約500bp的chsC基因片段，另一條為約7.45kb的pDHt/SK載體片段，通過測序比對進一步驗證片段插入的正確性。 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

7、對煙曲霉chsC基因的定點突變 二元載體pDHt/chsC-::hph用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌命名為EHA105/chsC-。ATMT中我們用不同的共培養(yǎng)溫度(23、24、25、26、27、28℃)，不同的轉(zhuǎn)化媒介(尼龍膜、硝化纖維素膜、液態(tài)靜置培養(yǎng))，不同的共培養(yǎng)時間(12、24、36、48h)，預(yù)培養(yǎng)加或不加AS，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中加入不同濃度的AS(100、200、300、400μg/ml

8、)，共培養(yǎng)時用不同的分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例(1:1、1:10、0:100、1:1000)，以此來探討影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的因素。用潮霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子接種到含高濃度潮霉素(200、400μg/ml)的LB培養(yǎng)基中初步鑒定轉(zhuǎn)化子，進一步鑒定用RT-PCR的方法。 二元載體pDHt/chsC-::hph可用氯化鈣法轉(zhuǎn)化進入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。用尼龍膜和液態(tài)靜置培養(yǎng)法在ATMT中具有相似的轉(zhuǎn)化效率，但硝化纖維素膜的轉(zhuǎn)

9、化效率明顯低于尼龍膜和液態(tài)靜置培養(yǎng)；共培養(yǎng)溫度為25℃時ATMT轉(zhuǎn)化效率最高，高于或低于該溫度轉(zhuǎn)化效率均有下降；隨著共培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)化效率也隨之增加，但共培養(yǎng)時間過長如72h，由于轉(zhuǎn)化子太多而不容易挑取單克隆；當(dāng)分生孢子與農(nóng)桿菌的比例在1:1到1:100時，隨著比例的增加ATMT轉(zhuǎn)化效率相應(yīng)提高，但當(dāng)其比例達到1:1000時，轉(zhuǎn)化效率不再增加；預(yù)培養(yǎng)加入AS與否對轉(zhuǎn)化效率無明顯影響，共培養(yǎng)時隨著加入AS濃度的增加其轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)提高

10、。陽性轉(zhuǎn)化子在含有高濃度的潮霉素環(huán)境中能正常生長。RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)化子發(fā)現(xiàn)ATMT能成功轉(zhuǎn)化T-DNA到煙曲霉染色體基因組中，定點插入并打斷失活chsC基因。 3.煙曲霉chsC基因缺失突變體基本特征的研究 等量突變體分生孢子和野生型煙曲霉分生孢子接種到察氏培養(yǎng)基中，37℃孵育3d觀察二者的生長速度。鋼圈法進行小培養(yǎng)以觀察煙曲霉chsC.突變體和野生型煙曲霉MIDA1在形態(tài)學(xué)上的差異，用微量培養(yǎng)法觀察二者對抗真菌藥物

11、敏感性的差異。應(yīng)用美國臨床實驗室標準化委員會制定的M38-A方案探討了煙曲霉chsC-突變體和野生型煙曲霉MIDA1對兩性霉素B(AmB)、特比奈芬(TBF)、伊曲康唑(ICZ)、氟胞嘧啶(5-Fc)和氟康唑(FCZ)的敏感性。 在生長速度方面，煙曲霉chsC-突變體生長速度明顯比野生型煙曲霉MIDA1慢，但大體菌落形態(tài)和顏色并無顯著變化。光鏡下野生型煙曲霉MIDA1，分生孢子鏈較短，分生孢子頭圓而飽滿，菌絲均勻飽滿。煙曲霉ch

12、sC-分生孢子鏈長，菌絲不均勻，部分可見膨大。電鏡高真空下野生型煙曲霉MIDA1，菌絲脫水塌陷，分生孢子較圓而飽滿；煙曲霉chsC-，菌絲脫水塌陷，分生孢子也脫水塌陷如癟乒乓球樣。電鏡低真空下野生型煙曲霉MIDA1，分生孢子及菌絲都較飽滿，分生孢子鏈較短；煙曲霉chsC-，菌絲易脫水塌陷，分生孢子鏈較長。野生型煙曲霉MIDA1與煙曲霉MIDA1(chsC-)對5-Fc、AmB、FCZ、ICZ的MIC值上無明顯差異，但相對于TBF煙曲霉M

13、IDA1(chsC-)的MIC值明顯低于野生型煙曲霉MIDA1。 結(jié)論： 1.用煙曲霉：EHA105和質(zhì)粒pDHt/SK組成的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能夠成功轉(zhuǎn)化T-DNA到煙曲霉染色體基因組中，當(dāng)T-DNA兩側(cè)含有與煙曲霉基因組同源序列時，T-DNA可以定點插入從而打斷和失活目標基因； 2.轉(zhuǎn)化媒介、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間、分生孢子與根癌農(nóng)桿菌的比例、共培養(yǎng)時加入AS的濃度均對ATMT的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生較大的影響，而預(yù)培養(yǎng)時加入A