馬尾松SSR引物開發(fā).pdf

1、本文利用馬尾松富集文庫來開發(fā)SSR引物。采用高效的微衛(wèi)星篩選分離策略：將基因組DNA 酶切，再進行選擇性擴增(AFLP DNA)；然后用生物素標記的 (AG)<,15>、(AC)<,15>混合探針與其雜交，雜交后的片段與包被在磁珠表面的鏈親和素 (streptavidin)結(jié)合，經(jīng)過一系列洗滌后，不含SSR部分被洗滌，而含有SSR的AFLP片段通過PCR擴增得到雙鏈目的片段，將這些片段連接到T載體上，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。經(jīng)PCR法檢測，最

2、后對58個克隆進行測序，向GENEBANK提交了27條非同源性序列。利用SSIHunter對序列進行微衛(wèi)星統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)含有微衛(wèi)星序列13個。分析微衛(wèi)星種類，其中 (TG/AG)n、(GA/CT)n比例最高，并發(fā)現(xiàn)三堿基重復(fù)微衛(wèi)星(AAG)n、(CTT)n、(AAG)n。 利用生物信息學(xué)的方法，對火炬松數(shù)據(jù)庫中的1000條EST序列進行了微衛(wèi)星篩選，結(jié)果得到50條含有微衛(wèi)星序列的EST序列。 利用軟件Primer5.0，對從

3、馬尾松富集文庫中得到的13個微衛(wèi)星序列和篩選出來的EST序列進行引物設(shè)計。用馬尾松7個個體進行多態(tài)性檢測，結(jié)果表明：其中有17對引物多態(tài)性較好。篩選出來的引物，進一步在黑松5個個體和雪松5個個體中進行了驗證。結(jié)果表明,M1和M15在黑松中成功擴增，表現(xiàn)出多態(tài)性；M1,M6和M14在雪松中成功擴增，表現(xiàn)出多態(tài)性。本實驗方法開發(fā)微衛(wèi)星引物的效率較高?？勺鳛閺鸟R尾松基因組中分離微衛(wèi)星DNA的有效方法。 首次采用磁珠富集馬尾松AFLP片