玉米苗期根系響應(yīng)重金屬鉛脅迫的基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，工礦業(yè)“三廢”的排放以及農(nóng)藥化肥的長期大量施用，土壤耕作層中的鉛等重金屬含量也不斷增加，這不僅嚴(yán)重影響玉米的正常生長和發(fā)育，同時也通過食物鏈的傳遞危及動物和人的健康。玉米在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，是一種重要的糧食作物，除籽粒外，其莖葉也是一些地區(qū)牲畜的青貯飼料重要來源。同時，玉米生物學(xué)產(chǎn)量較高，極有潛力成為新型土壤修復(fù)植物。植物通過一系列的生理，細(xì)胞和分子過程響應(yīng)，最終在脅迫不利條件下進(jìn)行生存。然而，很少有人研究玉米

2、在Pb脅迫下的表觀遺傳水平調(diào)控機(jī)制和分子機(jī)制。
　　在我們前期的研究中，以一定Pb濃度篩選玉米自交系，鑒定出自交系178和9782分別為高富集Pb和低富集Pb材料。為此，我們通過玉米自交系9782根系Pb脅迫下比較DNA甲基化動態(tài)變化分析和轉(zhuǎn)錄組動態(tài)分析，從而找到應(yīng)對Pb脅迫的相關(guān)候選基因。同時，為了進(jìn)一步鑒定Pb富集相關(guān)的重要候選基因和代謝途徑，利用自交系178根系在Pb脅迫下，進(jìn)行基因組表達(dá)譜分析。這些結(jié)果將拓寬我們對玉米根系

3、在Pb脅迫下不同生長發(fā)育時期的分子水平和細(xì)胞效應(yīng)的詮釋，也為今后研究在重金屬污染條件下玉米以及其它谷類作物的根系生長奠定一定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.為了進(jìn)一步了解玉米在重金屬Pb脅迫下抗氧代謝機(jī)制和脂質(zhì)過氧化作用，通過不同基因型玉米材料178，9782和組配雜交種F1在3 mM Pb(NO3)2苗期水培環(huán)境下，比較分析三個材料0-192 h不同時間段根系的生理生化差異。結(jié)果表明，Pb脅迫下根的伸長生長和毛根數(shù)量都急劇減少。自

4、交系178根系相關(guān)性狀要低于自交系9782和雜交種F1，但根系相對活性178和F1都高于9782。MDA含量178和F1卻低于9782。由于通過應(yīng)力狀態(tài)引起的脂質(zhì)過氧化作用，可以清除和解毒的SOD，POD和CAT保護(hù)酶。SOD酶活性178明顯高于其它兩個材料。POD酶活性178和F1高于9782。當(dāng)脅迫至96h時候，CAT酶活性178也明顯高于其它兩個材料。
　　2.采用甲基化DNA免疫沉淀測序技術(shù)(MeDIP-SEQ)，對玉米根

5、系中全基因組DNA甲基化模式進(jìn)行研究。通過對Pb低富集玉米自交系9782對照和不同處理時間段MeDIP-SEQ結(jié)果表明，平均甲基化密度最高的是CpG島，其次是基因間隔區(qū)域。在基因內(nèi)，內(nèi)含子的甲基化密度高于編碼區(qū)和外顯子。在四個樣本中總共找到3857個與甲基化相關(guān)的基因，其中處理K2，K3和K4分別與對照A1相比差異甲基化基因數(shù)量分別為1，805，1，508和1，660。進(jìn)一步分析表明，在三組對比研究中(K2 Vs.A1，K3 Vs.A1

6、，K4 Vs.A1)，總共有超過140個甲基化基因發(fā)生改變。其中主要包括一些關(guān)鍵的脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)，如MYB、AP2/ERF結(jié)構(gòu)、bZIP類、絲氨酸-蘇氨酸/酪氨酸蛋白、三角狀五重復(fù)蛋白、RING鋅指蛋白、F-box蛋白、富含亮氨酸重復(fù)蛋白以及三十四肽重復(fù)蛋白等。
　　3.在對低富集自交系9782的RNASeq測序研究中，總共約98Mreads用于基因結(jié)構(gòu)及多態(tài)性分析，從而鑒定玉米根系重金屬Pb脅迫下的轉(zhuǎn)錄豐度。在玉米根系

7、Pb處理的四個處理時間點0h、12h、24 h和48 h分別鑒定出了17，707、17，440、16，998、16，586個基因，其中在這四個時間點表達(dá)的基因數(shù)分別有2，825、2，626、2，161、2，260個。同時，基于轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探宄在低Pb脅迫下玉米根系不同時期的轉(zhuǎn)錄組變化，共鑒定出了384個差異表達(dá)基因(log2Ratio≥1，F(xiàn)DR≤0.001)。其中，在四個不同處理時間發(fā)現(xiàn)了36個顯著差異表達(dá)

8、基因，隨機(jī)挑選了12個進(jìn)行qRT-PCR驗證。本研究表明在玉米根系Pb脅迫不同處理時間發(fā)現(xiàn)響應(yīng)外界刺激的基因45個，與脅迫有關(guān)的42個，與蛋白質(zhì)代謝和結(jié)合有關(guān)的基因分別為164和224個。此外還發(fā)現(xiàn)了許多轉(zhuǎn)錄因子家族在不同發(fā)育時期可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，例如bZIP，ERF和GARP等。
　　4.在對高富集Pb自交系178的Pb脅迫DGE測序后，共獲得約11M cDNAtags，其中處理和對照clean tags分別為4，665，

9、539和4，936，038。與對照相比，Pb脅迫下有2379和1832個基因分別是上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量都超過對照的五倍。所有上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)的基因都與細(xì)胞過程和信號、信息存儲和處理、或者代謝功能相關(guān)。Pb脅迫下，這些涉及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖類轉(zhuǎn)運與代謝以及脂質(zhì)運輸和代謝等功能的差異表達(dá)基因相對于對照均有顯著改變。此外，包括核糖體、光合作用和暗反應(yīng)在內(nèi)的七條代謝途徑都受到顯著影響，處理與對照分別有1，181，