農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化及突變體分析.pdf

1、哈茨木霉是一種重要的生防真菌，從基因水平研究木霉菌關(guān)鍵基因的功能，可以加速對(duì)其生長(zhǎng)、生防、產(chǎn)孢機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為開(kāi)發(fā)高效、穩(wěn)定的生防制劑提供理論依據(jù)。利用分子標(biāo)簽技術(shù)獲得突變子已成為功能基因克隆的有效方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化是當(dāng)前獲得突變子的最優(yōu)方法之一。因此，本論文進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉轉(zhuǎn)化體系研究，初步構(gòu)建了哈茨木霉T-DNA插入突變體庫(kù)，對(duì)突變子進(jìn)行系統(tǒng)分析，取得如下結(jié)果： 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化及T-D

2、NA插入突變體庫(kù)構(gòu)建 針對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中8個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉轉(zhuǎn)化效率的影響建立了高效的哈茨木霉轉(zhuǎn)化體系：IM培養(yǎng)基中AS濃度為200μM，農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時(shí)間為6h，農(nóng)桿菌菌液濃縮4～5倍與濃度為106個(gè)/mL的木霉孢子懸液等體積混合，400μL混合液涂布到含200μMAS、pH為5.3、鋪有濾紙的共培養(yǎng)基上，24℃共培養(yǎng)48h。在該轉(zhuǎn)化條件下農(nóng)桿菌EHA105對(duì)哈茨木霉的轉(zhuǎn)化效率為60～150個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子。利用該轉(zhuǎn)

3、化系統(tǒng)構(gòu)建了含有4500株轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)，庫(kù)中的轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性高、轉(zhuǎn)化子基因組中T-DNA插入拷貝數(shù)為1-3個(gè)，其中80％為隨機(jī)單拷貝插入。 2.哈茨木霉孢子產(chǎn)生突變子的篩選和分析 采用PDA培養(yǎng)基、CHM培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基分別對(duì)突變體庫(kù)中的920株、2680株和1192株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行孢子產(chǎn)生突變體的篩選。利用PDA培養(yǎng)基篩選出8株孢子產(chǎn)生突變子，這些突變子與野生型哈茨木霉菌株相比，在孢子產(chǎn)生數(shù)量、菌落形態(tài)、分生孢子梗

4、形態(tài)等方面發(fā)生了變異；利用CHM培養(yǎng)基篩選出4株厚垣孢子產(chǎn)生減少的突變子、3株厚垣孢子產(chǎn)生減少同時(shí)分生孢子產(chǎn)生增多的突變子；利用PD培養(yǎng)基篩選出12株孢子產(chǎn)生突變子，其中5株分生孢子產(chǎn)生減少，菌絲上沒(méi)有厚垣孢子分化，另外7株分生孢子產(chǎn)生減少、菌絲上有厚垣孢子分化。 3.哈茨木霉生長(zhǎng)速度變異突變子和拮抗能力變異突變子的篩選和分析 測(cè)定600株轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，得到3株生長(zhǎng)速度降低的突變子，4株生長(zhǎng)速度增加的

5、突變子。測(cè)定1260株轉(zhuǎn)化子對(duì)立枯絲核菌的拮抗能力，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入對(duì)部分轉(zhuǎn)化子的拮抗能力產(chǎn)生了明顯影響，其中6株轉(zhuǎn)化子拮抗作用增強(qiáng)，17株拮抗作用減弱。 4.哈茨木霉T-DNA插入側(cè)翼序列分析 測(cè)定52株突變子右邊界側(cè)翼序列，得到42條可解析序列，其中7條為質(zhì)粒序列、33條對(duì)應(yīng)著單一序列、另外2條序列相同。34條序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入過(guò)程中右邊界序列存在一定程度的截短現(xiàn)象。另外，對(duì)34條序列的G+C％進(jìn)行分

6、析，其中92％的序列G+C％在44～56％之間(平均52.4％)。這與NCBI已公布的哈茨木霉EST序列G+C％含量相似，推斷T-DNA插入到了哈茨木霉基因區(qū)。 5.孢子產(chǎn)生突變子相關(guān)基因的克隆與序列分析 利用TAIL-PCR方法對(duì)孢子產(chǎn)生突變子T-DNA右邊界側(cè)翼序列進(jìn)行克隆，得到9條有效序列，將這些序列在Genbank中進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有6株轉(zhuǎn)化子的T-DNA右邊界側(cè)翼序列與已知基因具有同源性，推斷了相關(guān)序列的功能