AIV、ALV、IBV、IBDV四重RT-PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、禽流感病毒(Avianinfiuenzavirus，AIV)、禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)、禽傳染性支氣管炎病病毒(Infectiousbronchitisvirus，IBV)、雞傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)是四種嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的禽類傳染病重要病原。建立AIV、ALV、IBV和IBDV特異靈敏的檢測技術(shù)，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)傳染源，及盡早采取措施消除

2、傳染源，切斷疾病傳播途徑，降低疾病危害具有重要意義。
　　本研究根據(jù)ALV病毒M基因的保守序列，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)ALV簡并引物，參照文獻(xiàn)選擇AIV、IBV、IBDV的引物，以從AIV、ALV、IBV和IBDV的細(xì)胞培養(yǎng)液中抽提的病毒RNA作為模板，分別RT-PCR擴(kuò)增了他們各自特異的基因片段，成功構(gòu)建陽性對(duì)照質(zhì)粒pMD-18T-AIV、pMD-18T-ALV、pMD-18T-IBV和pMD-18T-IBD

3、V。
　　通過退火溫度、引物比例、引物濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度和PCR buffer濃度等條件的優(yōu)化，確定AIV、ALV、IBV和IBDV四重PCR最佳反應(yīng)條件為:AIV與IBV引物濃度為0.125μM，ALV與IBDV引物濃度為0.1875μM，PCR Buffe濃度為1.5×，Taq DNA聚合酶用量為0.075U/μL，Mg2+濃度為2.5mM，dNTP濃度為200μM。最佳退火溫度為52℃。
　　以10倍系列

4、稀釋的pMD-18T-AIV、pMD-18T-ALV、pMD-18T-IBV和pMD-18T-IBDV作為模板擴(kuò)增結(jié)果顯示，四重PCR檢測AIV、ALV、IBV和IBDV的靈敏度分別為102拷貝、103拷貝、102拷貝、103拷貝。以10倍系列稀釋的AIV、ALV、IBV和IBDV作為模板擴(kuò)增結(jié)果顯示，四重RT-PCR檢測AIV、ALV、IBV和IBDV的靈敏度分別為0.0001TCID50、100fg、0.00001TCID50和0.

5、001TCID50。
　　四重PCR擴(kuò)增pMD-18T-AIV、pMD-18T-ALV、pMD-18T-IBV和pMD-18T-IBDV或其中2、3和4種質(zhì)粒組合時(shí)，均可相應(yīng)產(chǎn)生1、2、3或4條特異性條帶;而檢測其它幾種禽類病毒APV、EDSV、MDV和NDV基因克隆質(zhì)粒時(shí)，均無特異性條帶產(chǎn)生。四重RT-PCR擴(kuò)增AIV、ALV、IBV和IBDV核酸或其中2、3和4種核酸組合時(shí)，也均相應(yīng)產(chǎn)生1、2、3和4條特異性條帶;而檢測其它幾

6、種禽類病毒APV、EDSV、MDV和NDV核酸時(shí)，均無特異性條帶產(chǎn)生。表明本研究建立的AIV、ALV、IBV和IBDV四重RT-PCR具有高度特異性，一次擴(kuò)增可檢測可以檢測出AIV、ALV、IBV和IBDV中任1種，或其中2、3和4種病毒的混合。
　　將細(xì)胞培養(yǎng)的AIV、ALV、IBV、IBDV單獨(dú)或其中2、3或4種病毒混合添加到經(jīng)單一PCR檢測陰性的禽類糞便制備人工陽性樣品，四重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，該方法可準(zhǔn)確檢測出四種病

7、毒中之1種，或其中2、3和4種病毒混合的人工陽性樣品。表明本研究建立的AIV、ALV、IBV和IBDV四重RT-PCR不僅可以用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)病毒的檢測，也適用于禽類組織和排泄物材料等臨床樣品中AIV、ALV、IBV和IBDV的檢測。
　　在武漢市虎泉集貿(mào)市場采集雞、鴨和鴿子糞便樣品各10份，在湖北省武漢市、大冶市采集六科7屬9種野生鳥類67只，分別提取病毒RNA四重RT-PCR檢測，結(jié)果在雞、鴨和鴿子糞便樣品中未檢測到AIV、AL