沉默Notch-1受體增強(qiáng)前列腺癌PC-3細(xì)胞對(duì)多西他賽藥物敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌是歐美老年男性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率長(zhǎng)期位居第一位，在我國(guó)其發(fā)病率也逐年上升。內(nèi)分泌治療是目前前列腺癌主要的治療方法，大多數(shù)患者起初對(duì)其敏感，但經(jīng)過18～24個(gè)月后，幾乎所有的患者發(fā)展為對(duì)激素不敏感，最后轉(zhuǎn)歸成為去勢(shì)難治性型前列腺癌(Castrate-resistant prostate cancer, CRPC)。CRPC的治療是以多西他賽(Docetaxel)為主的化學(xué)治療。多西他賽是半合成紫杉醇的衍生物，它可通過加強(qiáng)微管蛋

2、白聚合作用和抑制微管解聚作用，使細(xì)胞形成穩(wěn)定的非功能性微管束，因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，并阻滯細(xì)胞于G2/M期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，多西他賽可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中抑制凋亡的基因Bcl-2磷酸化，多西他賽還可以提高游離Bax蛋白水平，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。多西他賽是被FDA批準(zhǔn)用于治療CRPC的首個(gè)藥物，以其為主的抗腫瘤藥物聯(lián)合治療是目前CRPC治療標(biāo)準(zhǔn)方案。
　　 盡管多西他賽療效顯著，但其在中位6.3個(gè)月后常產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重

3、影響化療效果。目前，對(duì)于這類藥物的耐藥研究主要集中在紫杉醇耐藥，許多學(xué)者對(duì)肺癌、卵巢癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入的分析。研究發(fā)現(xiàn)，α和β微管蛋白的過度表達(dá)、微管蛋白的突變和微管蛋白翻譯后的修飾可以拮抗紫杉醇的微管穩(wěn)定作用，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，并能對(duì)抗紫杉醇誘導(dǎo)的聚合，降低微管聚合率，從而導(dǎo)致耐藥。同時(shí)，耐藥基因TRAG-3和P-糖蛋白表達(dá)升高可能也是導(dǎo)致紫杉醇耐藥的重要原因。另外凋亡基因或促凋亡基因的表達(dá)異常也是細(xì)胞發(fā)生耐藥的重

4、要原因。
　　 Notch是一種在進(jìn)化上十分保守的跨膜受體蛋自家族，其主要功能是參與多細(xì)胞生物胚胎期和出生后早期的生長(zhǎng)與發(fā)育過程。Notch信號(hào)途徑的精確調(diào)控，對(duì)大多數(shù)組織的正常發(fā)育至關(guān)重要;其異常凋控引起組織發(fā)育異常，并導(dǎo)致腫瘤等多種疾病的發(fā)生。已有多個(gè)研究顯示抑制Notch-1表達(dá)后腫瘤細(xì)胞凋亡增加，增殖和侵襲能力被抑制。多西他賽的抗腫瘤效果即體現(xiàn)在其通過對(duì)多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，其與Notch信號(hào)通路是

5、否存在交叉?zhèn)鲗?dǎo)，目前為止未見文獻(xiàn)報(bào)道。如果抑制Notch通路能夠增加多西他賽抗腫瘤的效果，此即可能成為前列腺癌治療的有效靶點(diǎn)。
　　 第一章Notch-1 siRNA的篩選及沉默Notch-1對(duì)PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的:合成并篩選有效的Notch-1 siRNA序列轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，了解沉默Notch-1對(duì)PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法:采用化學(xué)轉(zhuǎn)染法將針對(duì)Notch-1特異性序列的

6、3對(duì)不同siRNA轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，real time RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Notch-1 mRNA和蛋白的表達(dá)篩選出沉默效率最高的序列。將篩選的序列轉(zhuǎn)入PC-3細(xì)胞后行MTT檢測(cè)了解細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和行細(xì)胞周期分析，應(yīng)用Transwell小室法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力。
　　 結(jié)果:Notch-1 siRNA-6150的沉默效果最好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染Notch-1 siRNA

7、48 h后，PC-3細(xì)胞存活率由(98.50±0.99)％下降至(90.60±2.11)％(P＜0.05)，細(xì)胞凋亡率升高3.3倍(P＜0.05)，S期細(xì)胞比例由26.4％上升至41.4％(P＜0.05)，侵襲至Transwell小室濾膜下表面的PC-3細(xì)胞數(shù)由214.90±16.81個(gè)下降至136.56±9.94個(gè)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:沉默Notch-1受體不僅可抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡，將細(xì)胞周期阻滯于S期，

8、并且沉默Notch-1受體可降低PC-3細(xì)胞的侵襲能力。
　　 第二章沉默Notch-1基因協(xié)同多西他賽對(duì)PC-3細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制初探
　　 目的:了解沉默Notch-1受體能否增強(qiáng)多西他賽誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的作用，并了解凋亡相關(guān)因子Bcl-2家族成員Bcl-2和Bax表達(dá)的變化。
　　 方法:使用MTT法檢測(cè)不同濃度多西他賽作用于PC-3細(xì)胞不同時(shí)間發(fā)生細(xì)胞凋亡的情況。轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入前列腺癌PC-

9、3細(xì)胞沉默Notch-1受體并加入IC30多西他賽繼續(xù)作用，采用MTT檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，real time RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量，Westem Blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:經(jīng)過篩選，獲得50 ng/mL(60 nM)多西他賽濃度作用24h的實(shí)驗(yàn)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT測(cè)得轉(zhuǎn)染siRNA和多西他賽分別作用后干擾組的細(xì)胞存活率為(90.6

10、0±2.11)％，多西他賽組為(79.30±2.59)％。但聯(lián)合組細(xì)胞存活率下降更為明顯，為(64.50±2.25)％（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用后的細(xì)胞凋亡率為(17.16±0.61)％，較單純使用多西他賽((5.39±0.22)％)增加了3.2倍（P＜0.5）。干擾組和多西他賽組中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.5），而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.5)。更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)較干擾組和多西他

11、賽組，聯(lián)合組的Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.5)，而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.5）。
　　 結(jié)論:通過沉默Notch-1調(diào)控Bcl-2家族成員的表達(dá)，即抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)和促凋亡因子Bax的表達(dá)上調(diào)，能夠增加多西他賽對(duì)PC-3細(xì)胞的敏感性。
　　 第三章沉默Notch-1基因協(xié)同多西他賽對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響及機(jī)制初探
　　 目的:了解沉默Notch-1受體能否

12、增強(qiáng)PC-3細(xì)胞中多西他賽誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用，并了解細(xì)胞周期調(diào)控因子p21 waf1/cip1和Akt表達(dá)的變化。
　　 方法:轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入前列腺癌PC-3細(xì)胞沉默Notch-1受體并加入不同濃度多西他賽繼續(xù)作用，采用MTT檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖能力。沉默Notch-1受體并加入IC30多西他賽繼續(xù)作用，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、real time RT-PCR檢測(cè)p21waf1/cip1和Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)量

13、，Western Blot檢測(cè)p21waf1/cip1和Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)果:干擾組IC50由264.57±3.12 nM降至149.91±2.80 nM(P＜0.5)。我們發(fā)現(xiàn)在PC-3細(xì)胞中使用IC30劑量的多西他賽24 h后位于G2/M期的細(xì)胞比例由29.1％升至38.7％(P＜0.05)。聯(lián)合作用較單獨(dú)使用多西他賽其位于G2/M期的細(xì)胞比率明顯增加，由38.7％升至53.0％(P＜0.05)。聯(lián)合組的p21waf1/cip1的