高糖通過下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞PTEN表達(dá)促進(jìn)纖維化病變的機(jī)制及藥物干預(yù)研究.pdf

1、目的：本研究旨在觀察高糖對腎小管上皮細(xì)胞PTEN和PI3K/Akt信號通路以及EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白的表達(dá)變化的影響，同時(shí)進(jìn)一步探討洛伐他汀對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中PTEN和PI3K/Akt信號通路表達(dá)變化的影響及在腎小管纖維化病變中的作用及可能機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)，應(yīng)用免疫酶細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白角蛋白 CK-18、鈣黏蛋白(E-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白

2、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞；MTT實(shí)驗(yàn)檢測洛伐他汀對NRK52E生長活性的影響。細(xì)胞傳代后隨機(jī)分三組：(1)正常糖(NG)對照組：2％ FBS+DMEM(含糖5.5 mmol/L)培養(yǎng)；(2)高糖(HG)組：2%FBS+19.5mmol/L D-glucose+DMEM(含糖5.5 mmol/L)培養(yǎng)；(3)高糖+洛伐他汀(HR)組：2% FBS++19.5mmol/L D-glucose+DMEM(含糖5.5 mm

3、ol/L)+洛伐他汀(10uM)培養(yǎng)，各組細(xì)胞分別培養(yǎng)2h,12h,24h和48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)后收集蛋白和RNA進(jìn)行觀察；Western blotting檢測各組腎小管上皮細(xì)胞中PTEN、p-Akt(ser473)、E-cadherin、α-SMA和膠原蛋白Ⅳ(CollagenⅣ，Col-Ⅳ)蛋白表達(dá)；Real-time PCR技術(shù)檢測PTEN mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示為腎小管上皮細(xì)。
　

4、　(2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0-50uM濃度的洛伐他汀對細(xì)胞生長無明顯影響，根據(jù)參考文獻(xiàn)及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定適合濃度(10uM)對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。
　　（3）與NG組比較，HG處理12h、24h和48h時(shí)PTEN mRNA及蛋白表達(dá)明顯減少，并隨 HG處理時(shí)間的延長為進(jìn)行性減少，p-Akt(ser473)蛋白表達(dá)明顯增多，E-cadherin蛋白表達(dá)減少，α-SMA蛋白表達(dá)顯著增多，Col-Ⅳ沉積增多；予以洛伐他汀干預(yù)后，與高糖組比較