犬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定及fimN基因的克隆、表達和表達蛋白免疫原性分析.pdf

1、犬窩咳是由犬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)犬腺病毒(CAV)、犬瘟熱(CDV)和犬副流感病毒(CPiV)中的一種或幾種病原混合感染引起的。本實驗主要目的是了解犬支氣管敗血波氏桿菌在窩咳犬中的分布，分析比較Bb分離株的生物學特性，并同時比較三種病毒在窩咳犬中的檢出。從南京地區(qū)和北京地區(qū)采集了164份患有窩咳的犬鼻腔拭子進行Bb的分離鑒定，經(jīng)培養(yǎng)性狀、形態(tài)學檢查、生理生化試驗、血清學鑒定及PC

2、R鑒定，最終分離到16株Bb，分離率為9.8％，藥敏試驗結果顯示16株細菌生物學特性和對抗生素敏感性基本相同。對16份Bb陽性病料樣品進行犬腺病毒、犬瘟熱、犬副流感病毒檢測，結果表明窩咳犬由Bb引發(fā)的凡率占10％，和三種病毒混合感染的情況者占81％。 對2006年11月至2008年1月在北京和南京地區(qū)分離的16株犬波氏桿菌和一株兔波氏桿菌參考株的fimN基因進行了全長克隆，用MegAlign(DNAStar)比較分析分離株與Ge

3、nBank中收錄的犬波氏桿菌參考株(登錄號AF231910)的fimN核苷酸序列，繪制基因進化樹。結果表明，16株支氣管敗血波氏桿菌的fimN基因序列同源性與犬波氏桿菌參考株序列的同源性在99％以上，和兔波氏桿菌參考株的序列同源性也在99％以上，表明南京和北京兩地的犬源支氣管敗血波氏桿菌的fimN核苷酸序列基本無變化。 對克隆載體pMD18T-fimN進行雙酶切，將得到的630bp片段以正確的閱讀框架定向克隆于pET-32a(+

4、)中，構建PETBb-fimN重組質粒表達載體，然后將重組質粒轉化進宿主菌BL21中，在37℃1mM IPTG誘導下該片段獲得良好的表達。經(jīng)SDS-PAGE鑒定其表達的融合蛋白質約39.4kDa，與預期值一致，免疫轉印試驗顯示，體外表達的該重組蛋白可被兔支氣管敗血波氏桿菌NK0610株兔抗血清識別。表達蛋白純化后免疫實驗兔，通過瓊脂擴散試驗測血清抗體效價，結果顯示血清的沉淀效價為1:40，表明該重組蛋白具備天然菌毛蛋白N基因的部分抗原表