乳腺癌細胞中Vav1蛋白的調(diào)控機制和功能.pdf

1、本論文共包括兩部分,第一部分:乳腺癌中Vav1蛋白的調(diào)控機制和功能;第二部分:激酶PKR抑制肽的篩選。
　　第一部分:
　　乳腺癌是女性中致死率最高的癌癥。據(jù)報道,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和持久的曝露于雌激素環(huán)境有關。雌激素受體(estrogen receptor,ER)的表達和響應被視為乳腺癌分類和預后的重要分子標志之一。雌激素受體有兩種亞型,分別是ERα和ERβ。ERα多表達有乳腺和子宮,而ERβ具有更廣泛的表達分布,其還表達于

2、前列腺、卵巢、肺和脾臟。雌激素能夠以配體形式結(jié)合雌激素受體,并引起雌激素受體構(gòu)象發(fā)生變化,使之激活。激活的雌激素受體或通過結(jié)合靶基因啟動上的雌激素反應元件(estrogen response element,ERE),或通過結(jié)合啟動子上其他的轉(zhuǎn)錄因子,如AP1、SP1和E2F1,調(diào)控大量基因的表達,從而發(fā)揮調(diào)控細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡的作用。
　　Vav1最初因其缺失N端后在NIH3T3纖維細胞中的轉(zhuǎn)化作用而被認為是一個原癌基

3、因,隨后被鑒定為造血細胞特異性的鳥苷酸交換因子(guaninenucleotide exchange factor, GEF)。一系列的研究表明,Vav1是一個具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白,它不僅能夠以GEF活性依賴的形式激活RhoGTPase參與淋巴細胞的細胞骨架重組,還能以非GEF活性依賴的形式在T細胞中參與眾多的細胞過程,如鈣離子動員。
　　同時,越來越多的證據(jù)表明,Vav1蛋白也能夠在非造血細胞中表達,而且和幾種人類惡性腫瘤相關

4、,如神經(jīng)母細胞瘤、肺癌和胰腺導管腺癌。功能研究發(fā)現(xiàn),在肺癌和胰腺導管腺癌中沉默vav1表達能夠減少細胞增殖,而且也能夠減少在裸鼠中腫瘤的大小。另外,Vav1呈陽性的胰腺癌病人比Vav1呈陰性的病人展示出較差的預后效果以及較低的生存率。這些證據(jù)說明,Vav1蛋白的異常表達可能對人們癌癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。
　　近來,已有文獻報道在乳腺癌樣本中檢測到了Vav1的異常表達。本研究中,我們試圖探討在乳腺癌細胞中Vav1表達的機制及其

5、功能。我們首先用實時定量PCR(Quantitative real time PCR,qRT-PCR)的方法在乳腺癌樣本中確認了Vav1異常表達這一結(jié)論。同時我們也用Western Blot的方法在兩種ER陽性的乳腺癌細胞系中檢測到了Vav1的表達。繼而我們發(fā)現(xiàn),在乳腺癌細胞中,雌激素以一種時間梯度和濃度梯度依賴的方式通過雌激素受體α亞型上調(diào)vav1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達。進一步地,我們通過報告基因、染色體免疫共沉淀和蛋白免疫沉淀等手

6、段發(fā)現(xiàn)了ERα通過結(jié)合vav1基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子c-Myb和ELF-1與vav1基因啟動子相互作用行使對vav1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。最后,我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中沉默vav1表達,能夠抑制細胞周期蛋白Cyclin D1的表達和E2誘導的細胞周期進程,同時也發(fā)現(xiàn),Vav1過表達能夠促進乳腺癌細胞的細胞增殖。這些證據(jù)表明,雌激素可能部分地通過上調(diào)Vav1的表達來調(diào)控乳腺癌的細胞增殖。
　　第二部分:
　　雙鏈RNA依賴的蛋白激

7、酶(PKR)屬于真核翻譯起始因子eIF2α激酶家族,它通過磷酸化底物eIF2α使蛋白合成終止。PKR主要參與宿主對病毒感染的固有免疫反應,同時也在信號轉(zhuǎn)導、細胞生長、分化和凋亡的控制中起重要作用。PKR活性過高會導致免疫過激的病理反應。最近證實老年癡呆癥中PKR的異常激活導致神經(jīng)元的調(diào)亡。因此,PKR激酶的抑制劑在多種疾病的治療上有很好的應用潛力和價值,是一個被很多人關注的領域。
　　我們應用噬菌體展示12肽庫篩選PKR激酶結(jié)構(gòu)域