納米級(jí)超聲造影劑制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　通過控制脂質(zhì)體薄膜的厚度，在不需要制備納米級(jí)和微米級(jí)混合超聲造影劑(Ultrasound contrast agents，UCA)或者添加表面活性劑的條件下，直接制作出粒徑均一純的脂質(zhì)納米級(jí)超聲造影劑簡稱納米氣泡，進(jìn)一步分別檢測：1、其粒徑、電位、穩(wěn)定性等理化特性。2、離心對(duì)納米氣泡的影響。3、納米氣泡的細(xì)胞毒性。最后，通過與已商品化的微米級(jí)氣泡造影劑——聲諾維進(jìn)行體、內(nèi)外成像效果對(duì)比，評(píng)價(jià)納米氣泡增強(qiáng)顯影的效果及優(yōu)勢(shì)

2、。
　　方法:
　　納米氣泡制作方法為薄膜水化法。將7mg,14mg,21mg,28mg固定比例的二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG(2000)）分別加入4個(gè)25ml旋蒸瓶。再分別向4個(gè)旋蒸瓶內(nèi)各加入2ml氯仿，震蕩旋蒸瓶使脂質(zhì)體充分溶解。在此步驟，可加入少量紅色熒光染料DiI，為后續(xù)納米氣泡熒光檢測準(zhǔn)備。若加入在熒光染料 DiI，后續(xù)步驟需進(jìn)行避光處理，以防止熒光染料淬滅。在

3、55℃,120rpm/min條件下，各旋蒸瓶在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min，各瓶內(nèi)形成薄膜，隨著脂質(zhì)體用量增加，薄膜厚度增加。四個(gè)旋蒸瓶分別加入0.5ml,1ml,1.5ml,2ml水合液（10％甘油與90%PBS（V/V））后，將旋蒸瓶置于恒溫?fù)u床內(nèi)，在37℃,130 rpm/min條件下震蕩1小時(shí)，形成脂質(zhì)體懸液。取少量懸液做掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）檢測。每個(gè)旋蒸瓶內(nèi)取0.

4、5ml懸液置于密閉小管內(nèi)，抽空小管內(nèi)的氣體，并注入八氟丙烷（C3F8）。將小管放入銀汞調(diào)和器中震蕩45秒后，形成的乳白色液體。加入PBS將每個(gè)小管內(nèi)的乳白色液體稀釋至8ml。每組樣本各取2ml，動(dòng)態(tài)光散射儀(Dynamic Light Scattering，DLS)檢測其粒徑及電位，并取2ml聲諾維作為對(duì)照組。根據(jù)DLS結(jié)果，取少量納泡（14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制備）及聲諾維進(jìn)行SEM檢測及熒光顯微鏡觀測。將納米

5、去泡置于25℃條件下，分別于1min,15min,30min,45min和60min后檢測其粒徑及濃度，評(píng)估納米氣泡的穩(wěn)定性。根據(jù)DLS結(jié)果，取納米級(jí)與微米級(jí)混合造影劑（21mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制備），分別在20g,50g和805g條件下離心5分鐘，檢測其粒徑。利用MTT法檢測脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。在體外觀測納米氣泡與聲諾維的增強(qiáng)成像效果，利用軟件ImageJ采集灰階值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。建立荷瘤裸鼠模型，經(jīng)尾靜脈注入

6、納米氣泡及聲諾維，記錄增強(qiáng)顯影圖像，并利用軟件進(jìn)行灰階值采集，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。取荷瘤裸鼠的腫瘤和肌肉，制作病理切片，熒光標(biāo)記血管、細(xì)胞核，利用激光掃描共聚焦（confocal laser scan microscopy，CLSM）觀測帶熒光的納米氣泡和聲諾維組織位置。
　　結(jié)果:
　　4組樣本的粒徑分別為565.2±201.5nm(n=3),457.9±113.8nm(n=3),960.8±59.5nm(n=3),1121.

7、1±57.0nm(n=3)，聲諾維的粒徑為1614.8±224.7nm(n=3)。納米氣泡（14mgDPPC和DSPE-PEG(2000)制備）的電位結(jié)果為-21.48±7.46 mV(n=3)，而聲諾維的電位結(jié)果為-32.29±13.13 mV(n=3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后顯示，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.283)。SEM觀測下，納泡與聲諾維的形態(tài)相似，均為單一類圓形空洞，大小與DLS結(jié)果基本相同，脂質(zhì)體為類圓形小球。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在25

8、℃條件下，納米氣泡在制作后1min,15min,30min,45min和60min粒徑分別為457.9±113.8 nm(n=3),504.3±74.1 nm(n=3),519.5±95.5 nm(n=3),625.9±100.6 nm(n=3)和709.5±272.0 nm(n=3)，濃度分別為10.01×106±1.75×106/ml(n=5),9.31×106±1.22×106/ml(n=5),8.22×106±1.17×106/

9、ml(n=5),7.96×106±1.09×106/ml(n=5)和6.07×106±1.20×106/ml(n=5)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，60min后產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)納米級(jí)與微米級(jí)混合造影劑（14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)制備）進(jìn)行離心后發(fā)現(xiàn)，歷經(jīng)均有增大，20 g結(jié)果為828.4±425.7 nm(n=3)，50 g離心結(jié)果為882.1±417.6 nm(n=3)，805 g離心結(jié)果為977.2±65.9 nm(n

10、=3)。MTT法檢測脂質(zhì)體細(xì)胞毒性結(jié)果顯示：當(dāng)脂質(zhì)體濃度增加到10μg/ml時(shí)出現(xiàn)明顯毒性，而納米氣泡體內(nèi)成像時(shí)的脂質(zhì)體濃度小于5μg/ml。體外成像結(jié)果經(jīng)ImageJ采集灰階值后，納米氣泡為58.482±28.192 dB(n=5)，聲諾維為52.861±11.491 dB(n=5)。T檢驗(yàn)分析，兩者并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。荷瘤小鼠體內(nèi)成像結(jié)果顯示，經(jīng)尾靜脈注射后，納泡與聲諾維均有增強(qiáng)顯影。聲諾維和納米氣泡均在注射后30秒達(dá)到峰值。納泡成像持

11、續(xù)時(shí)間長于聲諾維。兩者在2min時(shí)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，納米氣泡成像強(qiáng)于聲諾維。病理切片CLSM結(jié)果顯示納米氣泡組腫瘤組織血管外細(xì)胞間有紅色熒光，而肌肉組織切片內(nèi)無紅色熒光；聲諾維組僅在腫瘤組織血管中見少量紅色熒光，而細(xì)胞間未見紅色熒光。
　　結(jié)論:
　　利用25ml旋蒸瓶，14mg DPPC和DSPE-PEG(2000)，通過薄膜水化法可以制作出厚度合適的脂質(zhì)體薄膜，在不需要制備納米級(jí)和微米級(jí)混合超聲造影劑或者添加表面活性劑的條