白芍總苷基于代謝組學的保肝機理及體內(nèi)代謝研究.pdf

1、白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)，是從傳統(tǒng)臨床常用中藥白芍中提取的有效部位。芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)和芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)是其主要的有效成分，在白芍總苷中含量最高。研究表明TGP具有明顯的保肝、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，對急、慢性化學性和免疫性肝損傷均有防治作用，有望成為保肝良藥，但是其作用機理尚不清楚，因此有必要研究白芍總苷的保肝機理。課題組前期對白芍總苷在急性

2、CCL4肝損傷大鼠模型、免疫性肝損傷大鼠模型的藥代動力學方面進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其吸收較少，生物利用度較低。推測在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用可能是白芍總苷代謝物，因此有必要研究白芍總苷的代謝。本研究擬基于代謝組學方法尋找四氯化碳誘導急性肝損傷大鼠模型的標志性差異代謝物，在此基礎上研究白芍總苷對其的調(diào)控作用，從而闡釋其保肝機理;擬基于液質(zhì)聯(lián)用技術，采用體內(nèi)的方法研究白芍總苷的代謝。
　　第一部分、白芍總苷基于代謝組學的保肝機理研究
　　

3、目的:利用LC-MS技術基于代謝組學思路同步并行分析四氯化碳誘導急性肝損傷大鼠模型血漿和尿液，尋找差異性代謝物。在此基礎上，進一步分析白芍總苷干預后，對差異代謝物的調(diào)控，闡釋白芍總苷的保肝作用機制。
　　方法:
　　1.動物和分組
　　健康wistar大鼠40只，(♂)，體重為240～280 g。按體重隨機分為4組:正常對照組、正常動物TGP給藥組、模型對照組和模型動物TGP給藥組。正常對照組和模型對照組灌胃給予純化水

4、，給藥組分別灌胃給予TGP。給藥劑量:1.41g/kg，給藥時間:14天。
　　2.生物樣品采集模型動物末次給藥后2h，腹腔注射50％ CCl4玉米油，10ml/kg(CCL4∶玉米油=1∶1)。每組尿液大鼠代謝籠中收集尿液;每組血漿大鼠斷頭取血，分為兩份血液分別處理得血漿和血清，置-80℃保存，備用。取肝左葉10％甲醛固定常規(guī)石臘包埋，HE染色。
　　3.樣品預處理
　　血漿，利用有機溶劑對血漿進行蛋白沉淀，渦旋，離

5、心，取上清液，乙腈水3∶1定溶至1mL，離心。尿液渦旋離心，乙腈與尿液1∶1沉淀蛋白，渦旋離心，取上清液，乙腈水3∶1定溶至1mL，渦旋混勻，離心。
　　4.色譜質(zhì)譜條件利用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple4500 System采集數(shù)據(jù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理
　　通過被測樣本的正、負離子檢測模式的Q-Triple4500 MS譜測定得原始數(shù)據(jù)，利用AB公司的markerview1.2.1代謝

6、組學分析軟件將數(shù)據(jù)轉換為二維數(shù)據(jù)陣。通過軟件SIMCA-P進行了多變量統(tǒng)計分析，PCA(PrincipalComponent Analysis)主成分分析、偏最小二乘判別分析PLS-DA(Partialleast-Discriminant Analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析OPLS-DA(Orthogonal Partial least-Discriminant Analysis, OPLS-DA)。結合AB公司的

7、shortcut to markerview1.2.1代謝組學分析軟件的t檢驗，分析標志性代謝物的組間差異。
　　6.差異代謝物的鑒別通過代謝物或化合物的數(shù)據(jù)庫HMDL、Massblank查找可能的代謝物。結合質(zhì)譜裂解規(guī)律解析可能代謝物的結構，從而推測確定可能的代謝物。
　　結果:生化檢測和病理組織學觀察結果表明造模成功，白芍總苷能防治四氯化碳誘導大鼠的肝損傷。通過代謝組學分析血漿中鑒定3個差異性代謝物，為丙氨酸、甘氨酸和脯

8、氨酸;尿液中9個代謝物，為丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺以及有機酸類己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、對羥基苯乙烯酸和3，4-二羥基苯丙酸。其中甘氨酸在血和尿液中均呈下降趨勢，尿液中的苯乙酸也為下降趨勢，其余均上升。TGP給藥組與空白對照組沒有明顯差異，說明藥物本身沒有影響。模型TGP給藥組回調(diào)丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸的水平，其他差異性代謝物變化不明顯。
　　結論:基于LC-MS液質(zhì)聯(lián)用技術的代謝組學方法，通過多變量統(tǒng)計分析能夠完全區(qū)分正

9、常對照、模型對照組和模型動物TGP給藥組樣本，表明其有明顯差異性;正常動物TGP給藥組與正常對照組區(qū)分不明顯，說明TGP藥物本身對動物的影響不明顯，不是造成正常對照、模型對照組和模型動物TGP給藥組的差異性原因。并且與傳統(tǒng)藥理學的生化檢測和病理組織結果一致。
　　通過分析正常動物和造模24小時內(nèi)動物的血漿和尿液的差異性代謝物，丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺水平異常，提示CCL4誘導急性肝損傷大鼠模型可能造成氨基酸代謝異常。有機酸

10、類己酸、苯乙酸、2-丙烯酸、對羥基苯乙烯酸和3，4-二羥基苯丙酸與腸道菌群的密切相關，因此腸道菌群也可能發(fā)生變化。
　　首次基于代謝組學方法分析白芍總苷干預CCL4誘導急性肝損傷大鼠模型后血漿和尿液的代謝物變化，檢測到丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸水平的回調(diào)，提示白芍總苷對CCL4誘導急性肝損傷大鼠模型有預防性保護作用。丙氨酸和脯氨酸的回調(diào)，推測TGP的調(diào)控可能與三羧酸循環(huán)有關。甘氨酸的回調(diào)說明TGP的調(diào)控可能與消除氧自由基的谷胱甘肽的合

11、成有關。對其他差異性代謝物無明顯的調(diào)控。
　　第二部分、白芍總苷的體內(nèi)代謝研究
　　目的:本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技術測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷單體和白芍總苷在大鼠體內(nèi)的代謝物，并比較芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在單體狀態(tài)和以白芍總苷有效部位形式給藥的代謝區(qū)別，明確白芍總苷體內(nèi)的代謝物和代謝途徑，闡釋其代謝特點。
　　方法:
　　1.動物和分組
　　健康Wistar大鼠60只，(♂)，體重為240～280 g

12、，分為4組:正常對照組、芍藥苷給藥組、芍藥內(nèi)酯苷給藥組、白芍總苷給藥組。正常對照組給予1ml/100g的水，其他給藥組給予各受試物5mg/kg。
　　2.生物樣品采集在代謝籠中收集尿液，總膽管插管采集膽汁，眼眶靜脈叢取血，肝素鈉抗凝，-80℃保存，備用。
　　3.樣品預處理
　　尿液和膽汁使用固相萃取小柱(SPE，Waters Sep-PakR Vac3cc，200mgC18 Cartridges)萃取富集。血漿在4℃

13、環(huán)境復溶，3∶1甲醇水對血漿進行蛋白沉淀，氮氣吹干，甲醇復溶。
　　4.色譜質(zhì)譜條件采用質(zhì)量虧損技術，利用AB SCIEX TripleTOFTM5600 System聯(lián)用采集數(shù)據(jù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理
　　根據(jù)對照品和血漿、膽汁和尿液中原形藥物質(zhì)譜，總結區(qū)分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)譜裂解規(guī)律。利用代謝途徑通過Metabolit1.5.1軟件多種方法尋找代謝物。
　　結果:通過分析，在體內(nèi)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷代謝以水解、

14、氧化和葡萄糖結合、葡醛酸結合反應為主。芍藥苷單體給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)10個代謝物，其中4個已知代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲?；炙庈?6個未知代謝物:芍藥苷結合葡萄糖C29H38O16，氧化芍藥苷C23H28O12，脫水去苯甲?；炙庈誄16H22O9，甲基化去苯甲?；炙庈盏膬蓚€異構體C17H26O10，甲基化去苯甲酰基芍藥苷脫水產(chǎn)物C17H26O9。芍藥內(nèi)酯苷單體給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)14個代謝

15、物，4個已知代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲?；炙庈?10個未知代謝物:氧化芍藥苷C23H28O12，脫水去苯甲?；炙庈誄16H22O9，甲基化去苯甲?；炙庈盏膬蓚€異構體C17H26O10，甲基化去苯甲?；炙庈彰撍a(chǎn)物C17H26O9，芍藥苷C23H28O11，加氫芍藥內(nèi)酯苷內(nèi)酯C23H30O11，蒎烷基本結構的甲基化代謝物C11H16O4的兩個異構體。白芍總苷給予大鼠后，在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)17個代謝物，4個

16、已知的代謝物:芍藥苷代謝素Ⅰ的兩個構型、芍藥苷代謝素Ⅱ和去苯甲?；炙庈?13個未知代謝物:氧化芍藥苷C23H28O12，二氧化芍藥苷C23H28O13，三氧化芍藥苷C23H28O14，脫水去苯甲?；炙庈誄16H22O9，甲基化去苯甲酰基芍藥苷的兩個異構體C17H26O10，甲基化去苯甲?；炙庈彰撍a(chǎn)物C17H26O9，芍藥苷C23H28O11，加氫芍藥內(nèi)酯苷內(nèi)酯C23H30O11，芍藥苷結合葡萄糖C29H38O16，芍藥內(nèi)酯苷結合

17、葡萄糖C29H38O16，芍藥苷結合葡醛酸C29H36O17，芍藥內(nèi)酯苷結合葡醛酸C29H36O17。
　　結論:本研究利用UFLC-Q-TOF-MS/MS技術分析了白芍總苷、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)的代謝物。分析測定了芍藥苷單體在大鼠體內(nèi)的10個代謝物，新發(fā)現(xiàn)6個代謝物。分析測定了芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)的14種代謝物，新發(fā)現(xiàn)10個代謝物。分析測定了白芍總苷在大鼠體內(nèi)的17個代謝物，新發(fā)現(xiàn)13個代謝物。結果提示主要發(fā)生了水解反應