綿羊BAD基因影常年發(fā)情性狀的功能研究.pdf

1、我國大部分綿羊為季節(jié)性發(fā)情品種，綿羊的季節(jié)性發(fā)情制約了養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)效率。綿羊常年發(fā)情可以提高生產(chǎn)效率，促進(jìn)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展，因此了解常年發(fā)情的分子機(jī)制，對改變綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀及新品種培育具有重要作用。本課題組前期通過RNA-Seq篩選發(fā)現(xiàn)BAD基因是常年發(fā)情及季節(jié)性發(fā)情綿羊卵巢組織中的差異表達(dá)基因。為了驗證RNA-Seq結(jié)果，并探索BAD基因在綿羊發(fā)情啟動中的作用機(jī)制，本研究對BAD基因進(jìn)行了功能鑒定。本研究以小尾寒羊卵巢上成熟卵泡為試驗材料

2、，用抽吸法分離卵泡顆粒細(xì)胞，構(gòu)建適合綿羊卵泡顆粒細(xì)胞生長的培養(yǎng)體系，并用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測卵泡顆粒細(xì)胞上特異性表達(dá)的促卵泡刺激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)蛋白，鑒定顆粒細(xì)胞純度;設(shè)計合成有效的BAD-siRNA，轉(zhuǎn)染原代綿羊卵泡顆粒細(xì)胞，以沉默BAD基因，用熒光定量PCR技術(shù)、Western-blot和細(xì)胞免疫熒光方法檢測BAD基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化，用

3、放射免疫方法檢測顆粒細(xì)胞分泌孕酮和雌二醇的濃度變化。獲得以下結(jié)果:熒光定量PCR檢測表明BAD基因在綿羊不同情期卵巢中的表達(dá)與前期測序結(jié)果一致，在發(fā)情前期的表達(dá)量顯著高于(P＜0.05)發(fā)情期、發(fā)情間期和休情期。我們所獲得的原代綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中FSHR陽性率高達(dá)98％，說明卵泡顆粒細(xì)胞純度較高。BAD-siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48小時后，熒光定量PCR檢測結(jié)果表明BAD基因在mRNA水平表達(dá)下降68.82％，Western-blot和細(xì)