水稻OsPEN1基因的克隆及功能初步研究.pdf

1、近年來，隨著許多抗性基因(R基因)的克隆，對植物與病原物相互作用分子機理的研究取得了許多突破性進展，推動了對植物抗性的研究。然而與R基因控制的植物抗性研究相比，對植物非寄主抗性分子基礎(chǔ)的認識還比較滯后。非寄主抗性是植物對大多數(shù)病原物產(chǎn)生抗性，對少數(shù)病原物感病，是最主要的抗病類型，它不是由植物單個?；钥共』蚩刂频模灰纂S著病原微生物的變異而喪失，具有穩(wěn)定持久抗性的特點，因此在農(nóng)業(yè)上有廣闊的應用前景。 大麥白粉病菌(Blumer

2、iagraminisfsp.Hordei，Bgh)對擬南芥本身是不致病的，通過篩選Bgh對擬南芥有高致病力的擬南芥突變體克隆了PEN基因，目前有三個基因AtPEN1(=AtSYP121)，AtPEN2租AtPEN3參與控制形成抗性物質(zhì)的生物合成和分泌過程，AtPEN1編碼一個可溶N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的因子適配器蛋白質(zhì)受體(SNARE)結(jié)構(gòu)域和質(zhì)膜定位的Syntaxin，參與調(diào)控囊泡的分泌途徑，說明存在與囊泡相關(guān)的抗性機制產(chǎn)生對粉

3、狀病原物的非寄主抗性。擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2對植物非寄主抗性的研究起著重要作用，我們通過研究也發(fā)現(xiàn)擬南芥AtPEN1對小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.trtici，Bgt)的非寄主抗性也同樣起著非常重要作用，水稻OsPEN1與擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2的同源性非常高，它們都含有非常保守的Qa-SNARE結(jié)構(gòu)域，南京農(nóng)業(yè)大學報道水稻OsNPSN11編碼的Qb-SNARE參與稻瘟病抗性，并將該

4、基因申請了專利。Qa-SNARE與Qb-SNARE同屬于SNARE蛋白家族，于是我們推測OsPEN1對水稻抗性起著重要作用。 本研究通過在NCBI網(wǎng)站上BLAST比對，在水稻日本晴中獲得了與擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2的同源序列OsPEN1，通過PCR法成功克隆了OsPEN1基因，對OsPEN1基因構(gòu)建過量表達和RNA干涉載體并通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻，通過PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株，然后通過RT-PCR及Northem雜

5、交分析轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株接種水稻真菌稻瘟病菌和紋枯病菌和水稻細菌白葉枯病菌進行抗病性鑒定，最后對OsPEN1蛋白進行生物信息學分析，其主要的研究結(jié)果如下： 1.0sPEN1基因的克隆。由于OsPEN1基因無內(nèi)含子，以水稻日本晴植株總DNA為模板，設(shè)計OsPEN1基因的特異引物，PCR法克隆了OsPEN1基因，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，并連接進pMD18-T載體中，酶切、測序鑒定重組陽性質(zhì)粒。 2.植物表達載體的構(gòu)建

6、。將重組質(zhì)粒和植物的表達載體分別用相應的限制酶酶切后，將酶切的OsPEN1片段亞克隆到表達載體中構(gòu)建重組表達載體，用酶切、PCR鑒定和測序的方法鑒定出重組陽性質(zhì)粒pCAMBIA-OsPEN1和pUC-OsPEN1，然后通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻日本晴。 3.T0轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。獲得卡那霉素抗性植株22株RNA干涉和22株過量表達轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)PCR檢測，從22株過量表達水稻植株中獲得了20株轉(zhuǎn)基因陽性苗，從22株RNA

7、干涉水稻植株中獲得了17株轉(zhuǎn)基因陽性苗。 4.0sPEN1基因的RT-PCR分析。取轉(zhuǎn)基因植株葉片提取RNA，對OsPEN1進行RT-PCR，發(fā)現(xiàn)OsPEN1的過表達水稻植株的表達水平明顯高于對照植株，RNA干涉水稻植株低于對照植株，表明在轉(zhuǎn)錄水平上，OsPEN1在轉(zhuǎn)基因水稻植株中得到了正常表達。分別取接種紋枯病菌前和接種紋枯病菌后的轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取RNA，對PR-1，NPR-1基因進行RT-PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株接種紋

8、枯病菌后其表達水平比接種前高，說明OsPEN1的表達受到紋枯病菌的誘導。 5.轉(zhuǎn)基因植株的Northernblotting分析。對轉(zhuǎn)基因陽性植株進行Northernblotting分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，12株過量表達轉(zhuǎn)基因陽性苗比對照表達量高，10株RNA干涉水稻轉(zhuǎn)基因陽性苗比對照表達量低，表明OsPEN1在轉(zhuǎn)基因植株中得到了正常的表達。 6.轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定。分別對轉(zhuǎn)基因RNA干涉和過量表達水稻植株接種水稻稻

9、瘟病菌，水稻白葉枯病菌和水稻紋枯病菌進行抗病性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因過量表達水稻植株比轉(zhuǎn)基因RNA干涉水稻植株表現(xiàn)為抗病，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旮胁顟B(tài)介于兩者之間，OsPEN1基因表現(xiàn)出對多種病菌抗病，可能與植物的非寄主抗性有關(guān)。 7.生物信息學分析。OsPEN1蛋白含一個跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)域為284-305區(qū)域。OsPEN1蛋白的212-274位點為Qa-SNARE核心結(jié)構(gòu)域，核心結(jié)構(gòu)域比較保守，OsPEN1蛋白的Qa-SN