脂肪干細胞構建組織工程化角膜基質(zhì)的實驗研究.pdf

1、目的：探討兔脂肪干細胞（rabbit adipose-derived stem cells，rASCs）的生物學特性及其復合多孔支架材料聚羥基乙醇(PLGA)的生物相容性。在此基礎上，進一步探討以自體、異體rASCs 作為種子細胞分別復合PLGA 支架材料構建組織工程角膜基質(zhì)修復角膜基質(zhì)層缺損的可行性，評價其修復效果并探討作用機制，為角膜組織工程種子細胞和生物支架材料的研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法：（1）采用消化法分離培養(yǎng)兔脂

2、肪干細胞，傳至第四代驗證其多向分化功能。（2）熒光染料DiO 標記第四代脂肪干細胞并將其接種于多孔PLGA 支架，hoechst 法定量檢測細胞在支架上的生長情況，并分別于接種后第1，3，7 天對細胞-生物材料復合物行共聚焦顯微鏡和掃描電鏡檢測，觀察細胞在該支架上的粘附生長和細胞外基質(zhì)分泌情況。（3）腺病毒轉染綠色熒光蛋白（green fluoresence protein, GFP）標記兔脂肪干細胞，示蹤細胞的轉化轉歸。構建兔角膜基質(zhì)

3、缺損模型，自體和異體rASCs-PLGA 復合物體外培養(yǎng)7 天后分別回植到相應角膜基質(zhì)缺損模型的角膜基質(zhì)層間，術后第12 周和24 周取材行大體觀、組織學和透射電鏡超微結構觀察比較修復效果。單純?nèi)睋p不加移植物組和未接種細胞的PLGA 材料移植組作為對照組。（4）熒光顯微鏡檢測自體和異體rASCs-PLGA 組角膜基質(zhì)層間GFP 的表達，免疫熒光檢測相應部位角膜基質(zhì)細胞特異性蛋白多糖keratocan 和胞漿蛋白ALDH1A1 的表達。<

4、br>　　 結果：（1）體外培養(yǎng)的第四代rASCs 具有成骨，成脂，成軟骨等多向分化功能。（2）細胞接種至PLGA 支架材料上增殖明顯，第7 天細胞生長達到平臺期，掃描電鏡和共聚焦顯微鏡檢測顯示細胞在支架上貼附生長良好，能夠在支架表面及孔隙內(nèi)壁得到充分伸展和生長，細胞外基質(zhì)分泌旺盛。（3）體內(nèi)實驗中自體rASCs-PLGA 組移植術后12 周材料降解，角膜基本恢復透明，異體rASCs-PLGA 組術后24 周仍未恢復透明。組織學檢查顯

5、示移植術后24 周自體rASCs-PLGA 組新生角膜基質(zhì)樣組織與正常角膜基質(zhì)組織相似，異體rASCs-PLGA 組仍有明顯缺損區(qū)域存在。電鏡下膠原纖維直徑比較顯示，各組術后24 周膠原直徑均較12 周時均一、排列也趨于整齊，自體rASCs-PLGA 組角膜基質(zhì)膠原直徑纖維排列與正常角膜基質(zhì)最為相似，異體組次之。（4）熒光顯微鏡下可見自體rASCs-PLGA 組和異體rASCs-PLGA組角膜基質(zhì)層間均有GFP陽性細胞表達，自體組多于異

6、體組。免疫熒光檢測顯示自體和異體組植入的細胞表達角膜基質(zhì)細胞特異性蛋白多糖keratocan 和胞漿蛋白ALDH1A1。
　　 結論：體外培養(yǎng)的兔脂肪干細胞具有多向分化功能，與多孔PLGA支架具有良好的生物相容性，作為種子細胞來源可以構建出具有良好組織學結構的組織工程角膜基質(zhì)用以修復角膜基質(zhì)缺損，且自體細胞修復效果優(yōu)于異體細胞。植入脂肪干細胞在體內(nèi)微環(huán)境誘導下向角膜基質(zhì)細胞表型轉化，為脂肪干細胞多向分化功能提供了新的實驗依據(jù)。<