抑制Pin1基因?qū)Υ竽c癌HCT116細(xì)胞端粒酶活性的影響.pdf

1、研究背景：
　　大腸癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，致死率較高，約占所有癌癥死亡人數(shù)的8％，是目前繼肺癌、胃癌及肝癌之后第四大最常見(jiàn)的癌癥死亡原因。近年來(lái)，大腸癌的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。因此大腸癌的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明，其中細(xì)胞惡性增殖是導(dǎo)致大腸癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因。
　　PIN1（peptidy-脯氨酰順/反異構(gòu)酶PPIase）是一個(gè)高度保守的、特定的肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶的家庭成員，它在包括大腸癌在內(nèi)的不同類(lèi)型的惡性

2、腫瘤過(guò)度表達(dá)。Pin1蛋白中含有一個(gè)的N端的WW結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域。WW結(jié)構(gòu)域與p-Ser/Thr-Pro基序特異性結(jié)合，使之發(fā)生順?lè)串悩?gòu)，從而改變目的蛋白的空間構(gòu)型，進(jìn)一步改變目的蛋白功能，調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用。Pin1蛋白可參與多種控制細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括P53，E2F，NF-κB，CyclinD1，Cdc25C蛋白，β-catenin，AP-1，NFAT，NIMA和Wee-1。目前，Pin1蛋白已

3、作為抗癌劑的藥物靶標(biāo)之一。而我們先前的研究已成功構(gòu)建質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1,它具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可有效下調(diào)Pin1基因的表達(dá)。最近研究表明，抑制Pin1導(dǎo)致人類(lèi)細(xì)胞中端粒逐步缺失。
　　端粒作為染色體的末端，由人類(lèi)染色體的末端重復(fù)序列d(TTAGGG)n和相關(guān)蛋白構(gòu)成。端?？梢员３秩旧w穩(wěn)定性，但會(huì)隨著細(xì)胞分裂逐漸縮短。而端粒酶則可添加端粒重復(fù)序列到3'末端端粒區(qū)，以維持端粒長(zhǎng)度，保持基因組穩(wěn)定性。在大部分正常人體細(xì)胞和

4、組織中，端粒酶沒(méi)有活性，但在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，包括直結(jié)腸癌組織中，該酶是有活性的。該酶的核心組成蛋白催化亞基——端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)，由人TERT基因(hTERT)編碼，而hTERT的轉(zhuǎn)錄很大程度上取決于其啟動(dòng)子活性。研究表明，多種調(diào)節(jié)蛋白可與hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，如c-myc，SP1，P53，E2F和NF-κB/p65。近期報(bào)道表明，抑制端粒酶的表達(dá)，抑制端粒酶活性可能成為一個(gè)新的腫瘤基因治療的目標(biāo)。
　　目的：

5、r>　　研究在人類(lèi)大腸癌HCT116細(xì)胞中，抑制Pin1基因?qū)Χ肆Ｃ富钚缘挠绊懠捌渥饔脵C(jī)制。
　　方法：
　　1.擴(kuò)增Pin1基因干擾表達(dá)載體pGenesil-1-Pin1（縮寫(xiě)P-shRNA）和對(duì)照載體pGenesil-1-CON(簡(jiǎn)寫(xiě)p-CON)，雙酶切載體后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及DNA測(cè)序鑒定載體。
　　2.利用脂質(zhì)體將質(zhì)粒p-shRNA及其對(duì)照組p-CON轉(zhuǎn)入大腸癌HCT116細(xì)胞，通過(guò)觀(guān)察轉(zhuǎn)染48h后HCT

6、116細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
　　3.提取各組HCT116細(xì)胞總RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)Pin1在各組大腸癌HCT116細(xì)胞RNA表達(dá)情況；提取各組細(xì)胞總蛋白，利用Westernblotting檢測(cè)其Pin1蛋白表達(dá)水平的情況。
　　4.采用流式細(xì)胞檢測(cè)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-shRNA質(zhì)粒及p-CON質(zhì)粒后的凋亡率。
　　5.提取各組細(xì)胞端粒酶，利用TRAP-銀染法分析端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在各組人類(lèi)大

7、腸癌HCT116細(xì)胞的活性水平。利用qRT-PCR檢測(cè)hTERT在各種大腸癌HCT116細(xì)胞的RNA表達(dá)情況。
　　6.利用免疫熒光與Westernblotting檢測(cè)p-NF-κB/P65在各組HCT116細(xì)胞中的定位及聚集情況。利用DNA電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)檢測(cè)在各組HCT116細(xì)胞中NF-κB/P65與hTER的結(jié)合活性。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)鑒定確認(rèn)成功提取Pin1基因的RNA干擾表達(dá)載體。

8、　　2.利用脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后，觀(guān)察綠色熒光蛋白，計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率達(dá)61%。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，Pin1的表達(dá)明顯下調(diào)(0.392±0.072-fold(P=0.001))，Pin1表達(dá)抑制率達(dá)61.8%。Westernblotting檢測(cè)也支持該結(jié)果。
　　4.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：下調(diào)Pin的表達(dá)可使細(xì)胞凋亡率上調(diào)(16

9、.40％±1.54％(P<0.05))。
　　5.TRAP-銀染法結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，端粒酶活性顯著下調(diào)(0.384±0.015(P<0.05))，其表達(dá)抑制率達(dá)60.28%。qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil-1-Pin1后，hTERT轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著減少(0.171±0.060-fold(P=0.001))，其表達(dá)抑制率達(dá)61.8%。
　　6.免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示p-NF-

10、κB/p65主要聚集于細(xì)胞核且其聚集量隨Pin1下調(diào)而下調(diào)。電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，證明NF-κB/P65蛋白能與hTERT啟動(dòng)子結(jié)合，其結(jié)合力隨Pin1下調(diào)而下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，成功提取Pin1基因的RNA干擾表達(dá)載體，使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸癌HCT116細(xì)胞可抑制Pin1基因的表達(dá)。
　　2.經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)Pin1基因表達(dá)可以有效促進(jìn)人大腸癌HCT116細(xì)胞凋亡；同時(shí)可以抑制該細(xì)胞中端粒酶