家蠶核型多角體桿狀病毒BmNPV orf98基因的功能分析.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是昆蟲病毒類中的最大的類群之一，它編碼的蛋白質種類有90到180種，基因組大小為80～180 kb之間。目前家蠶桿狀病毒(BmNPV)大部分基因的功能都已被研究，但仍然有一些基因的功能至今未知。因此，本論文就家蠶核型多角體桿狀病毒BmNPV orf98基因為研究對象，研究該基因對病毒基因組的復制、轉錄以及病毒包裝和基因表達等方面的影響。家蠶核型多角體病毒BmNPV orf98基因不是桿狀病毒的核心基因，

2、此基因的插入或刪除對BmNPV傳染性沒有明顯的影響，但在病毒的復制、轉錄和包裝等方面的影響至今未見報道。為了研究BmNPV orf98基因功能，通過λRed重組系統(tǒng)進行定點敲除BmNPV orf98基因，構建缺失型重組病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系統(tǒng)異位補回BmNPV orf98基因，構建補回型重組病毒Bm98-re-Bacmid。將野生型病毒(WtBacmid)、缺失型病毒（Bm98-ko-Bacmid）和

3、補回型（Bm98-re-Bacmid）分別轉染家蠶細胞BmN。病毒滴度檢測結果顯示Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子，但數量降低;透射電子顯微鏡結果表明Bm98-ko-Bacmid只產生游離的桿狀病毒粒子，數量明顯減少，而WtBacmid和Bm98-re-Bacmid產生大量成熟的具有囊膜結構的病毒粒子。熒光定量PCR結果顯示BmNPV orf98基因缺失對BmNPV病毒復制沒有影響，但早期基因lef3、晚期基因vp39

4、和極晚期基因p10的轉錄水平而顯著降低(p＜0.05)。上述結果表明:BmNPVorf98基因對病毒的復制是非必需的，但該基因的缺失引起早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉錄水平明顯下降(p＜0.05)。為了研究BmNPV orf98的基因表達，構建了BmNPV orf98的原核表達載體，表達融合蛋白并制備多克隆抗體進行Western印跡。結果表明:用該融合蛋白作為抗原進行Western印跡，條帶單一且濃，說明抗體可用

5、。然后用該抗體和轉染了補回型病毒的家蠶細胞進行Western結果顯示:隨著轉染時間的延長，ORF98蛋白在家蠶(BmN)細胞中的表達量也隨之增長。綜合研究結果表明:BmNPV orf98基因為病毒復制非必需基因，但該基因的缺失能夠抑制病毒增殖和包裝，且導致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉錄顯著下降(p＜0.05)。BmNPVorf98基因編碼的蛋白在不同表達時相分析，隨著時間的延長，該蛋白表達量也隨

6、之增多。
　　在桿狀病毒基因組上將目的基因敲除或者突變是研究未知功能病毒基因最有效的方法。在本文中，通過Red重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構建Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid兩種重組病毒，然后將wtBacmid、Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid病毒DNA分別轉染家蠶細胞(BmN)，收集不同時相的病毒上清并進行10-1～10-12的梯度稀釋，五天后統(tǒng)計細胞發(fā)病孔數和未發(fā)病

7、孔數，按照相應的公式計算TCID50。實驗結果表明隨著轉染時間的延長3種病毒的TCID50也隨之增大，將收集的病毒上清進行二次感染，細胞仍然發(fā)病，說明缺失型病毒仍然能產生具有感染性的BV。但在同一時相，缺失型病毒的TCID50低于wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒且缺失型病毒轉染的家蠶細胞發(fā)病時間較其它兩者晚，說明該基因的缺失推遲了病毒發(fā)病時間，抑制了病毒的增殖;而將該基因補回后病毒滴度恢復到野生型水平，說明這種缺陷能通

8、過基因補回得到恢復且BmNPV orf98不是BmNPV病毒粒子裝配的必需基因。而后在透射顯微鏡下觀察48 h時相三種病毒粒子的包裝情況，結果顯示缺失型病毒只產生游離的桿狀病毒粒子，且數量明顯減少，而野生型和補回型病毒產生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子;為了進一步了解BmNPV orf98的作用機制，將三種病毒分別轉染家蠶細胞，熒光定量分析結果顯示野生型、缺失型和補回型3種病毒的復制水平保持一致，無顯著性差異(p＞0.05)，但該基因的

9、缺失導致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉錄顯著下降(p＜0.05);在轉染48 h和72 h時相，wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒的轉錄水平趨于一致且明顯高于Bm98-ko-Bacmid的轉錄水平。為了研究BmNPV orf98的基因編碼的蛋白在不同時相的表達，構建了BmNPV orf98的原核表達載體，表達融合蛋白并制備多克隆抗體進行Western印跡。結果表明:用該融合蛋白作為

10、抗原進行Western印跡，條帶單一且濃，說明抗體可用。然后用該抗體和轉染了補回型病毒的家蠶細胞進行Western印跡結果顯示:隨著轉染時間的延長，BmNPV orf98蛋白在家蠶(BmN)細胞中的表達量也隨之增長。綜合研究結果表明:BmNPV orf98基因為病毒復制非必需基因，但該基因的缺失抑制了病毒的增殖和包裝，且導致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉錄顯著下降(p＜0.05)。同時，BmNPV