擬穴青蟹耐寒相關(guān)基因ANT2、CCTα和SCD的分子克隆與脅迫應(yīng)答.pdf

1、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenine nucleotide translocase，ANT)，屬于線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，是線粒體中最豐富的蛋白質(zhì)之一，主要作用是介導(dǎo)ADP/ATP在細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)之間的運(yùn)輸。伴侶素包含T型復(fù)合體(the chaperonin containingtailless complex polypeptideα，CCTα)是幾乎存在所有生物體中的一類(lèi)分子伴侶，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白的組裝和折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的硬脂酰去飽和酶(st

2、earoyl-CoAdesaturase，SCD)，是一類(lèi)含鐵離子的限速酶，主要催化硬脂酰輔酶A(C18∶0)和軟脂酰輔酶A(C16∶0)向油酸(C18∶1)和棕櫚油酸(C16∶1)等單不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并在C9-C10之間引入雙鍵。為探討這3個(gè)基因在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)低溫脅迫中的作用，本文采用RT-PCR、RACE等技術(shù)，首次從擬穴青蟹中獲得了ANT2、CCTα、SCD的cDNA全長(zhǎng)序列，并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量

3、PCR技術(shù)檢測(cè)了三個(gè)基因，在不同組織和不同溫度以及不同溫度鹽度聯(lián)合條件下的表達(dá)譜。主要結(jié)果如下:
　　1) ANT2的研究結(jié)果:
　　擬穴青蟹ANT2序列全長(zhǎng)1348 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為930 bp，編碼309個(gè)氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有3個(gè)保守的線粒體跨膜功能結(jié)構(gòu)域;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，ANT2基因在成熟擬穴青蟹雌體的心臟組織中表達(dá)最高，其次分別是鰓和肌肉組織。在10℃、15℃、20℃和25℃等4個(gè)

4、溫度條件下，第一期仔蟹(C1)的ANT2基因在10℃和15℃表達(dá)量顯著低于20℃和25℃，且10℃的表達(dá)量顯著低于15℃;另外，隨著溫度降低，幼蟹ANT2基因總體上趨低表達(dá)。低溫下C1仔蟹和幼蟹ANT2基因表達(dá)變化，提示該基因與能量代謝功能相關(guān)，可能參與擬穴青蟹低溫脅迫應(yīng)答;相同低溫(10℃和15℃)下，幼蟹肌肉、肝胰腺、鰓三種組織中ANT2基因在鹽度10的表達(dá)量通常高于鹽度35，說(shuō)明低溫低鹽條件下青蟹需要進(jìn)一步提高體內(nèi)代謝來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅

5、迫。
　　2) CCTα的研究結(jié)果:
　　擬穴青蟹CCTα序列全長(zhǎng)1972 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1668 bp，編碼555個(gè)氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有4個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域;實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果表明CCTα基因在擬穴青蟹肌肉組織中表達(dá)量最高，其次是鰓和肝胰腺;幼蟹在4個(gè)溫度下，肌肉、肝胰腺、鰓中CCTα基因表達(dá)量在10℃均顯著高于15℃、20℃、25℃;15℃下的表達(dá)量顯著高于20℃和25℃。這些數(shù)據(jù)表明該基

6、因可能參與青蟹細(xì)胞中蛋白修復(fù)和細(xì)胞骨架構(gòu)建的過(guò)程，來(lái)應(yīng)對(duì)低溫脅迫;在低溫和鹽度聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)中，相同低溫(10℃和15℃)下，三種組織中CCTα基因在鹽度35的表達(dá)量通常低于鹽度10，說(shuō)明低溫下高鹽環(huán)境對(duì)青蟹損傷較小。
　　3) SCD研究結(jié)果:
　　擬穴青蟹SCD序列全長(zhǎng)1356 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為1041 bp，編碼347個(gè)氨基酸殘基。同源分析顯示，該蛋白具有4個(gè)跨膜區(qū)域和三個(gè)組氨酸功能區(qū)域;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明

7、SCD基因在擬穴青蟹所有檢測(cè)組織中均有表達(dá)，且在肝胰腺組織中表達(dá)量最高;在4個(gè)溫度下，C1期仔蟹SCD基因表達(dá)量在15℃均顯著高于10℃、20℃、25℃;20℃和25℃二者之間差異不顯著。SCD可能在增加不飽和脂肪酸進(jìn)而增加細(xì)胞膜流動(dòng)性中參與了擬穴青蟹低溫脅迫應(yīng)答。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹存在ANT2、CCTα、SCD三個(gè)基因。這三個(gè)基因在低溫下的表達(dá)模式和三個(gè)基因各自發(fā)揮的功能顯示它們可能與青蟹的寒冷適應(yīng)有關(guān)。研究結(jié)果