玻璃化冷凍保存對(duì)體外成熟豬卵母細(xì)胞與胚胎DNA的影響.pdf

1、卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存是一種有效保護(hù)動(dòng)物遺傳資源的方法。利用簡(jiǎn)便快速的玻璃化冷凍保存技術(shù)，可以建立雌性動(dòng)物基因庫(kù)、保存珍稀生物資源，為其保護(hù)和保存提供了不受時(shí)間和地域限制的新途徑。 本研究以廢棄豬卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞為材料。通過(guò)玻璃化冷凍技術(shù)保存體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得的成熟卵細(xì)胞和囊胚。使用單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）方法和連接介導(dǎo)PCR（LMPCR）技術(shù)檢測(cè)冷凍前后卵母細(xì)胞和囊胚的DNA損傷情況。旨在建立一套完善的豬卵母細(xì)胞冷凍

2、保存體系和DNA損傷評(píng)估方法。為卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存和冷凍損傷等研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。 通過(guò)階段性試驗(yàn)研究，得出結(jié)論如下： 1. 玻璃化冷凍保護(hù)劑對(duì)體外成熟豬卵母細(xì)胞DNA的影響 以EDFS40為冷凍保護(hù)劑平衡冷凍前體外成熟豬卵母細(xì)胞。采用細(xì)胞形態(tài)觀察和單細(xì)胞凝膠電泳（彗星電泳）方法檢測(cè)玻璃化冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞DNA的損傷情況。結(jié)果顯示：保護(hù)劑處理組，細(xì)胞形態(tài)正常率和DNA異常率分別為63.36％、42.0

3、6％；同無(wú)保護(hù)劑處理對(duì)照組84.51％、12.28％的差異顯著（P<0.05）。表明冷凍保護(hù)劑對(duì)豬卵母細(xì)胞DNA有一定影響；以彗星電泳檢測(cè)和CASP軟件分析保護(hù)劑處理對(duì)體外成熟豬卵母細(xì)胞的毒性作用。保護(hù)劑處理組TailDNA％與HeadDNA％的比值相對(duì)較高，表明DNA損傷較高。而在OTM值比較中，保護(hù)劑處理組斜率比對(duì)照組更大。說(shuō)明冷凍保護(hù)劑對(duì)豬卵母細(xì)胞DNA有明顯細(xì)胞毒性作用。 2.玻璃化冷凍保存對(duì)豬卵母細(xì)胞DNA的影響

4、 采用EDFS40為保護(hù)劑微管法玻璃化冷凍保存體外成熟豬卵母細(xì)胞。設(shè)EDFS40處理組為對(duì)照，檢測(cè)玻璃化冷凍保存過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞的細(xì)胞毒性及DNA損傷作用。冷凍組進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)及DNA異常率為63.36％和42.06％，而對(duì)照組為59.02％和25.76％。說(shuō)明冷凍保存對(duì)細(xì)胞形態(tài)和DNA均有一定的影響。對(duì)處理組細(xì)胞進(jìn)行彗星電泳檢測(cè)分析，通過(guò)CASP軟件分析所得數(shù)據(jù)得出冷凍組比保護(hù)劑處理組的OTM值較大，表明總體DNA較保護(hù)劑處理有明顯

5、損傷。運(yùn)用連接介導(dǎo)PCR技術(shù)，對(duì)細(xì)胞基因組中定位特定p53基因進(jìn)行斷裂檢測(cè)。結(jié)果顯示：冷凍組的基因擴(kuò)增有明顯的條帶，與預(yù)計(jì)的片段大小相符。而對(duì)照組無(wú)處理卵母細(xì)胞擴(kuò)增卻很少片段產(chǎn)生，初步確認(rèn)為冷凍造成p53基因損傷斷裂。 3.玻璃化冷凍和保護(hù)劑對(duì)豬囊胚細(xì)胞DNA的毒性試驗(yàn) 以冷凍效果較好的EDFS40保護(hù)劑玻璃化凍存豬囊胚細(xì)胞。采用形態(tài)評(píng)估和彗星電泳方法檢測(cè)囊胚的形態(tài)變化及DNA的損傷情況。目的在于探討玻璃化冷凍保護(hù)劑對(duì)囊

6、胚的化學(xué)毒性作用和冷凍過(guò)程對(duì)其DNA的影響。結(jié)果顯示：經(jīng)保護(hù)劑處理和冷凍的囊胚形態(tài)正常率為56.46％和35.84％，有較多出現(xiàn)皺縮和細(xì)胞塌陷現(xiàn)象。冷凍組囊胚存活率為25％與對(duì)照組44.44％有較大差異（P<0.05）。彗星電泳檢測(cè)結(jié)果：保護(hù)劑處理組囊胚DNA異常率為53.45％，冷凍組DNA異常率為79.14％，差異顯著（P<0.05）。CASP軟件分析得出：冷凍組、處理組和未處理組的OTM值有明顯區(qū)別，曲線斜率越大，DNA損傷程度越