甘藍(lán)型油菜-諸葛菜附加系中雌不育和花色的形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、蕓薹科諸葛菜屬的諸葛菜(Orychophragmus violaceus(L.) O.E.Schulz，2n=24，OO)具有一些特異的形態(tài)特征（如紫花）。通過體細(xì)胞融合產(chǎn)生諸葛菜與甘藍(lán)型油菜(Brassica napusL.，2n=38，AACC)的雜種(2n=62，AACCOO)并與甘藍(lán)型油菜連續(xù)回交，獲得的一些附加系(2n=39，AACC+IO)也表現(xiàn)諸葛菜的特異形態(tài)性狀（紫花色素）及新性狀（雌不育）。本研究選取表現(xiàn)雌性不育新特性

2、和淡紅色花瓣的兩個(gè)附加系為材料，顯微解剖觀察雌性不育附加系的雌蕊發(fā)育過程，然后利用RNA-Seq技術(shù)分析雌蕊的基因表達(dá)模式，揭示雌蕊發(fā)育的遺傳調(diào)控;通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析淡紅色油菜花瓣附加系中花青素合成代謝通路，找到調(diào)控花青素合成的影響因子，并對(duì)候選基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:
　　1.雌不育附加系雌蕊發(fā)育的比較解剖觀察
　　與正常的甘藍(lán)型油菜比較，雌不育附加系(S1)的雌蕊完全敗育，從花蕾長(zhǎng)度為2mm左右的早期階段就

3、發(fā)育受阻，比正常雌蕊短很多，不能結(jié)實(shí)?；ǚ酃苊劝l(fā)試驗(yàn)表明S1雌蕊柱頭能粘附少量花粉粒并萌發(fā)，但花粉管螺旋生長(zhǎng)不能穿入乳突細(xì)胞。掃描電鏡結(jié)果表明S1柱頭較小，且乳突細(xì)胞為短的圓球狀而非正常的長(zhǎng)指頭狀。DIC觀察透明處理胚珠發(fā)現(xiàn)S1的胚珠內(nèi)外珠被都敗育，其中內(nèi)珠被能起始發(fā)育但不能繼續(xù)生長(zhǎng)，而外珠被完全不起始發(fā)育。裸露的珠心組織內(nèi)大孢子母細(xì)胞可以進(jìn)行減數(shù)分裂形成四分體，但發(fā)生異常退化且不能形成正常的功能大孢子，即胚囊發(fā)育停滯在大孢子發(fā)生階段。

4、
　　2.雌不育附加系的轉(zhuǎn)錄組分析
　　通過RNA-Seq技術(shù)對(duì)S1和甘藍(lán)型油菜受體“華雙3號(hào)”(H3)的雌蕊進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，分別獲得7，502，922(99.14％)和6，990，973(99.03％)條clean reads。與參考基因序列Brassica_95k_unigene進(jìn)行比對(duì)后分別獲得28,065和27，653個(gè)unigenes，以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出4540個(gè)

5、DEGs（Differentially expressed genes），2155個(gè)在S1中上調(diào)，2385個(gè)下調(diào)。GO和pathway富集分析發(fā)現(xiàn)了很多與雌性發(fā)育性狀相關(guān)的過程，比如胚囊發(fā)育、雌配子體發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、花粉粒-雌蕊相互作用等。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，最后根據(jù)表型和測(cè)序數(shù)據(jù)提出了一個(gè)雌性不育植株中依賴BR、生長(zhǎng)素、HD-ZIPⅢ基因以及它們之間相互作用的雌蕊發(fā)育模型。
　　3.

6、淡紅色花瓣附加系的轉(zhuǎn)錄組分析
　　淡紅色花瓣的二體附加系(4-10)花瓣上在原有的黃色背景下呈現(xiàn)不同深度及不同面積大小的紅色，通過對(duì)4-10和“華雙3號(hào)”(H3)，及天然的紫花(Zihua)和白花(Baihua)諸葛菜的花瓣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得了14G的測(cè)序數(shù)據(jù)，有效reads總數(shù)為1.15億，每個(gè)樣品大約有3000萬(wàn)左右的reads，接近90％為clean reads。以白菜（Brassica rapa）基因組為參考序列進(jìn)行比

7、對(duì)，4-10和H3大約各有60％的clean reads唯一比對(duì)或多位點(diǎn)比對(duì)到基因組上，分別獲得31956和30979個(gè)基因;Zihua和Baihua都只有10％的clean reads唯一比對(duì)或多位點(diǎn)比對(duì)到基因組上，分別獲得30009和30275個(gè)基因。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)4-10和H3之間有9917個(gè)DEGs，Zihua和Baihua之間有3818個(gè)DEGs。對(duì)兩組DEGs分別進(jìn)行基因功能分類，獲得類似的結(jié)果，在具有紫色或紅色花瓣的樣品

8、中，與光合作用及光刺激應(yīng)答相關(guān)的類群都下調(diào)表達(dá)了，與蛋白質(zhì)翻譯活性相關(guān)的上調(diào)了。花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示大部分結(jié)構(gòu)基因在4-10和Zihua中都是上調(diào)的，特別是ANS。Baihua中只有一個(gè)調(diào)控因子GL3顯示差異表達(dá)，且下調(diào)為0;4-10中有10個(gè)調(diào)控因子為DEGs，其中顯著上調(diào)的PAP2基因經(jīng)組裝拼接和序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)是來自于諸葛菜基因的轉(zhuǎn)錄本。
　　4.淡紅花附加系與諸葛菜PAP2和ANS基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

9、
　　依據(jù)組裝序列及白菜基因組序列信息分別克隆了4-10和諸葛菜中的PAP2和ANS基因，結(jié)果顯示4-10中的PAP2序列與諸葛菜中的確實(shí)完全一致;4-10中獲得兩個(gè)拷貝的ANS序列，分別對(duì)應(yīng)與一個(gè)白菜中的拷貝和一個(gè)甘藍(lán)中的拷貝，諸葛菜中也獲得了兩個(gè)拷貝的ANS序列。以4-10中的PAP2和其中一個(gè)拷貝的ANS序列，以及諸葛菜中其中一個(gè)拷貝的ANS序列為標(biāo)準(zhǔn)分別構(gòu)建了三個(gè)過表達(dá)載體PAP2-7、ANS-12和AZKR-7。轉(zhuǎn)化擬南