白藜蘆醇對(duì)人膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)作用的初探.pdf

1、目的:人腦膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，均具有較高的侵襲性及擴(kuò)散性，目前臨床上尚無(wú)有效治療手段，即使采用手術(shù)結(jié)合放化療也會(huì)給患者預(yù)后造成很大影響。有研究表明，藥物治療是提高患者生存質(zhì)量的重要手段。白藜蘆醇是具有多種生物學(xué)功效的天然多酚類化合物，其抗腫瘤作用日趨受到重視，本課題旨在研究白藜蘆醇對(duì)腦腫瘤細(xì)胞系蛋白質(zhì)組的影響，探討白藜蘆醇可能的作用機(jī)制及細(xì)胞系敏感性差異原因，尋找可能存在的抗腫瘤作用靶點(diǎn)或腫瘤耐藥機(jī)制，為深

2、入開(kāi)展本領(lǐng)域研究、實(shí)現(xiàn)藥物臨床轉(zhuǎn)化及腫瘤個(gè)體化治療提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括(1)蛋白質(zhì)水平的影響:觀察對(duì)白藜蘆醇存在敏感性差異的不同腦腫瘤細(xì)胞系，在白藜蘆醇藥物處理前后，蛋白質(zhì)組的改變。(2)篩選及鑒定:選取若干藥物處理前后存在差異表達(dá)的蛋白，運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其蛋白屬性加以鑒定。(3)差異蛋白質(zhì)驗(yàn)證:采用免疫組化和RT-PCR等方法，對(duì)鑒定出的蛋白在白藜蘆醇處理前后細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行核實(shí)。(4)數(shù)據(jù)整理分析:繪制可能存在的調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的生

3、物網(wǎng)絡(luò)。
　　方法:(1)篩選與藥物處理:選取兩種腦腫瘤細(xì)胞系（膠質(zhì)瘤及髓母細(xì)胞瘤），每種細(xì)胞系再分別選取對(duì)白藜蘆醇敏感性存在差異的細(xì)胞系（膠質(zhì)瘤敏感型:U251、欠敏感型:LN18及髓母細(xì)胞瘤敏感型:UW228-3、欠敏感型:DAOY）。細(xì)胞系U251、LN18及UW228-3培養(yǎng)于低糖DMEM培養(yǎng)基(Low-Dulbecco's ModifiedEagle Medium，L-DMEM)中，DAOY培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(

4、Roswell ParkMemorial Institute1640，RPMI1640)中，各培養(yǎng)基中分別含有10％胎牛血清和1％抗生素（青霉素和鏈霉素），藥物處理組用100μM的白藜蘆醇（Resveratrol，簡(jiǎn)寫(xiě)Res）處理48h，收取細(xì)胞片用HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)蛋白雙向電泳分離及質(zhì)譜鑒定:收取細(xì)胞提取全蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳(two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE)，蛋白質(zhì)酶切技術(shù)對(duì)

5、變化差異點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)酶切，質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry，MS)對(duì)酶切樣品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。(3)蛋白鑒定結(jié)果驗(yàn)證:采用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡技術(shù)對(duì)發(fā)現(xiàn)的新的蛋白結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)調(diào)節(jié)新蛋白表達(dá)的基因進(jìn)行基因水平的驗(yàn)證。
　　結(jié)果:(1)形態(tài)學(xué)改變:細(xì)胞系U251及UW228-3白藜蘆醇處理前后形態(tài)及數(shù)量上都有明顯的變化，均出現(xiàn)了神經(jīng)元樣變化且細(xì)胞數(shù)量減少，而細(xì)胞系LN18及DAOY經(jīng)過(guò)白藜蘆醇處理前后

6、，其形態(tài)和數(shù)量上幾乎沒(méi)有改變，提示:U251、UW228-3細(xì)胞系和LN18、DAOY細(xì)胞系對(duì)白藜蘆醇存在明顯敏感性差異。(2)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn):1）蛋白質(zhì)組整體影響:主要以上調(diào)為主，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，U251實(shí)驗(yàn)組，正常組N檢出310個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)照組Res共檢出271個(gè)蛋白點(diǎn)，其中電腦軟件匹配結(jié)果共170個(gè)，上調(diào)比64.7％;在LN18細(xì)胞系中，正常組N檢出422個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)照組Res共檢出405個(gè)蛋白點(diǎn)，電腦軟件匹配共269個(gè)，上調(diào)比6

7、4.3％。髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，DAOY組中，正常組N共檢出298個(gè)點(diǎn)，對(duì)照組Res共檢出342個(gè)點(diǎn)，軟件匹配234個(gè)，上調(diào)比42.7％; UW228-3組中，正常組N共檢出177個(gè)點(diǎn)，對(duì)照組Res共檢出118個(gè)點(diǎn)，軟件配對(duì)69個(gè)，上調(diào)比49.3％。2）差異蛋白質(zhì)鑒定:蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果為烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶，角蛋白，膜聯(lián)蛋白，膜突蛋白，熱休克蛋白等。(3)差異蛋白質(zhì)的驗(yàn)證:隨機(jī)選取幾個(gè)蛋白進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，ENO1、PDIA1、

8、AKR1B1等均表現(xiàn)為用藥后表達(dá)水平下降，而兩種角蛋白在兩種敏感性細(xì)胞系中幾乎未檢測(cè)到表達(dá)，在不敏感細(xì)胞系用藥后略有升高，CAP1在DAOY和U251中出現(xiàn)了上調(diào)，CAP1在UW228-3中下調(diào)明顯，在LN18中變化不明顯。(4)選取的表達(dá)共性的蛋白烯醇化酶ENO1的WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均出現(xiàn)了藥物處理后下調(diào)，與雙向電泳結(jié)果符合。
　　結(jié)論:(1)初步得到了四種腦腫瘤細(xì)胞系白藜蘆醇處理前后蛋白質(zhì)表達(dá)譜