循環(huán)甲基化DNA作為胃癌診斷和預(yù)警標(biāo)志物及胃癌細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、目的：從DNA甲基化角度尋找胃癌診斷和預(yù)警的標(biāo)志物，研究標(biāo)志物之一的MYLK在胃癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。此外，為探討胃癌發(fā)生的機(jī)制，研究胃癌細(xì)胞周期各時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中基因表達(dá)譜的變化。
　　 方法：通過NimbleGen啟動(dòng)子區(qū)域CpG島芯片，對(duì)9株胃癌細(xì)胞株和6例正常胃粘膜組織的DNA進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢測(cè)，篩選出胃癌高甲基化基因作為候選的胃癌診斷和預(yù)警標(biāo)志物。然后用甲基化特異性PCR(MSP)方法分別在58例胃癌患

2、者(術(shù)前/術(shù)后)、46例胃癌癌前疾病患者(不典型性增生、腸化生和慢性萎縮性胃炎)和30例健康人的血清標(biāo)本中驗(yàn)證，并對(duì)候選標(biāo)志物分子做臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析。
　　 以免疫組化染色檢測(cè)62對(duì)胃癌患者的腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中MYLK的表達(dá)。分別從胃癌患者腫瘤和癌旁組織中分離、培養(yǎng)原代腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和癌旁成纖維細(xì)胞(CPFs)，并檢測(cè)MYLK在其中的表達(dá)。以siRNA方法下調(diào)CAFs中MYLK的表達(dá)，并將下調(diào)前后

3、的CAFs分別與胃癌細(xì)胞SGC7901共培養(yǎng)，觀察單獨(dú)培養(yǎng)的SGC7901細(xì)胞(SGC7901組)，和CAFs共培養(yǎng)的SGC7901細(xì)胞(SGC7901+CAFs組)，及其和MYLK下調(diào)后的CAFs共培養(yǎng)的SGC7901細(xì)胞(SGC7901+CAFs-MYLK(-)組)增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化。以細(xì)胞因子芯片檢測(cè)CAFs和SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)上清、單獨(dú)CAFs、SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的差異。觀察CAFs和SGC

4、7901細(xì)胞共培養(yǎng)后以及外源性HGF、IGFBP-1和MYLK特異性抑制劑作用于CAFs后，MYLK表達(dá)、CAFs生物學(xué)特性及SGC7901細(xì)胞后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的改變。
　　 以胸腺嘧啶核苷(thymidine)-偌考達(dá)唑(Nocodazole)及雙胸腺嘧啶核苷(doublethymidine)法進(jìn)行細(xì)胞同步化，分別阻斷并于釋放后0-12h收集細(xì)胞，流式

5、細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞同步化的程度。選擇細(xì)胞周期中9個(gè)不同關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣本并抽提mRNA，用cDNA microarray分析基因表達(dá)譜差異。
　　 結(jié)果：甲基化芯片篩選出82個(gè)差異基因，其啟動(dòng)子區(qū)域在胃癌中高甲基化，正常胃粘膜中低甲基化或未發(fā)生甲基化。MSP檢測(cè)候選基因BCAS4、CHRM2、FAM5C、PRAC和MYLK在胃癌患者、胃癌癌前疾病患者和健康人血清中的甲基化陽(yáng)性率：BCAS4分別為32.8％(19/58)、54.4％

6、(25/46)和100％(30/30)；CHRM2分別為31.0％(18/58)、15.2％(7/46)和6.7％(2/30)；FAM5C分別為31.0％(18/58)、6.5％(3/46)和3.3％(1/30)；PRAC分別為65.5％(38/58)、28.3％(13/46)和36.7％(11/30)；MYLK分別為70.7％(41/58)、28.3％(13/46)和6.7％(2/30)。CHRM2，F(xiàn)AM5C和MYLK的甲基化陽(yáng)性率

7、隨病情進(jìn)展呈正相關(guān)性。其中胃癌患者血清中FAM5C和MYLK在胃癌患者術(shù)后血清中的甲基化陽(yáng)性率較術(shù)前有明顯下降(P<0.001)。評(píng)價(jià)甲基化聯(lián)合檢測(cè)用于胃癌診斷意義的ROC曲線，F(xiàn)AM5C和MYLK聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積(AUC=0.838)高于單個(gè)基因(0.639和0.820)。FAM5C和MYLK甲基化聯(lián)合檢測(cè)在胃癌患者和癌前疾病患者中的敏感性分別達(dá)到77.6％(45/58)和30.4％(14/46)，特異性達(dá)到90％。FAM5C和M

8、YLK聯(lián)合甲基化檢測(cè)陽(yáng)性率術(shù)后為24.1％(14/58)，明顯低于術(shù)前的77.6％(45/58)(P<0.001)。FAM5C和MYLK聯(lián)合甲基化檢測(cè)與腫瘤大小(P<0.001)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.001)和TNM分期(P=0.003)有相關(guān)性。
　　 組織免疫組化染色顯示62例胃癌腫瘤和癌旁組織標(biāo)本中有45例(72.6％)MYLK表達(dá)于腫瘤組織的間質(zhì)細(xì)胞，而在腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)；在45例間質(zhì)表達(dá)的標(biāo)本中有27例(60

9、％)MYLK的表達(dá)腫瘤組織中高于癌旁組織。原代成纖維細(xì)胞CAFs中的FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表達(dá)量高于CPFs(P<0.05)。與CAFs共培養(yǎng)后SGC7901細(xì)胞的增殖能力明顯升高(P=0.018)；而與SGC7901+CAFs組相比，將CAFs中的MYLK下調(diào)后則不能增加SGC7901細(xì)胞的增殖能力，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)。與CAFs共培養(yǎng)后SGC7901細(xì)胞的凋亡率雖有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P=0

10、.169)；而與SGC7901+CAFs組相比，將CAFs中的MYLK下調(diào)后則明顯促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的凋亡(P=0.032)。與SGC7901組相比，SGC7901+CAFs組SGC7901細(xì)胞的遷移(37.2±15.992 vs77.7±13.483，P<0.05)和侵襲(28.1±3.315 vs59.1±7.141，P<0.05)增加；與SGC7901+CAFs組相比，SGC7901+CAFs-MYLK(-)組SGC7901細(xì)

11、胞的遷移(77.7±13.483 vs61.0±13.132，P<0.05)和侵襲(59.1±7.141 vs50.8±5.160，P<0.05)減少。CAFs和SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)后，HGF和IGFBP-1細(xì)胞因子表達(dá)均明顯升高。CAFs與SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)后或?qū)⑼庠葱缘腍GF或IGFBP-1作用于CAFs后，CAFs中FAP、α-SMA和MYLK的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而抑制CAFs中MYLK的活性后，F(xiàn)A

12、P、α-SMA和MYLK mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。同時(shí)SGC7901細(xì)胞與CAFs共培養(yǎng)后或?qū)⑼庠葱缘腍GF和IGFBP-1作用于SGC7901細(xì)胞后，其EMT標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)降低，而N-cadherin、Twist1、Twist2、Snail、Slug mRNA表達(dá)升高，具有明顯的EMT特征性變化(P<0.05)。
　　 表達(dá)譜芯片篩選出得到2001個(gè)在9個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可信的基因，其中959個(gè)

13、基因在細(xì)胞周期中發(fā)生明顯的上調(diào)或下調(diào)。其中細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因有2個(gè)，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因有12個(gè)，細(xì)胞周期相關(guān)基因有16個(gè)，染色質(zhì)蛋白相關(guān)基因有7個(gè)，DNA復(fù)制相關(guān)基因有4個(gè)，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因有56個(gè)，DNA修復(fù)相關(guān)基因有2個(gè)，蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因有91個(gè)，癌基因15個(gè)，黏附分子相關(guān)基因8個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因101個(gè)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因33個(gè)，代謝相關(guān)基因160個(gè)，其他未分類的基因有448個(gè)。
　　 結(jié)論：血清FAM5C和MYLK聯(lián)合甲基化檢測(cè)在

14、胃癌和癌前疾病中的敏感性和特異性均高于目前臨床上的一般檢測(cè)手段；可用于評(píng)估手術(shù)效果和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)；并能對(duì)臨床病理分期和腫瘤浸潤(rùn)深度起到一定的提示作用，有望成為胃癌診斷和預(yù)警的標(biāo)志物。
　　 CAFs可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。MYLK是調(diào)控胃癌CAFs生物學(xué)特性的一個(gè)重要分子，并有可能成為潛在的CAFs活化標(biāo)志物。
　　 胃癌細(xì)胞周期各時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中發(fā)生廣泛的基因表達(dá)譜改變，為胃癌發(fā)生機(jī)理的闡明提供了研究基礎(chǔ)。