H-,2-O-,2-誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡及ERK信號調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的氧療是臨床上用于提高血氧飽和度、改善組織缺氧狀態(tài)的一種常用治療手段，但是長時(shí)間持續(xù)吸入高濃度氧可導(dǎo)致肺氧化應(yīng)激性損傷。肺泡II型上皮細(xì)胞(ATII細(xì)胞)作為肺泡上皮的干細(xì)胞在肺損傷修復(fù)中的作用尤為重要，而與細(xì)胞增殖、存活和凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)可能在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對ATII細(xì)胞修復(fù)存活產(chǎn)生影響。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠ATII細(xì)胞為研究對象，探

2、討活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)誘導(dǎo)ATII細(xì)胞存活、凋亡變化及ERK對ATII細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。 方法以免疫粘附法純化分離的大鼠ATII細(xì)胞，過氧化氫(H202)處理模擬機(jī)體ROS攻擊ATII細(xì)胞的體內(nèi)情況，建立氧化性細(xì)胞損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為對照組(加無血清培養(yǎng)基)、H202處理組(無血清培養(yǎng)基中含10、100、500和1000pMH202)和ERK干預(yù)組。采用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變

3、化，以四甲基偶氮唑鹽酶反應(yīng)比色法fMTT法)檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測H202處理后ATII細(xì)胞磷酸化ERK(P-ERK)的表達(dá)，并觀察ERK特異性抑制劑PD98059干預(yù)后細(xì)胞凋亡率的變化。 結(jié)果以胰蛋白酶分離，免疫粘附法純化建立ATII細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法可收獲細(xì)胞1．2×107個(gè)／鼠，純度和活性>90％。H2O2作用ATII細(xì)胞3h，與對照組比較，10vM處理組的

4、細(xì)胞生長形態(tài)無明顯差異；100μM處理組細(xì)胞間隙稍增寬；隨著H202濃度的增高，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞體積減小，1000μMH202處理時(shí)，大量細(xì)胞變圓，皺縮明顯，可見脫壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，透射電鏡下觀察到典型的凋亡細(xì)胞和凋亡小體。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，10μM和100μMH202處理3h，細(xì)胞存活率和凋亡率無明顯變化(P>0.05)，500μM和100OμmH202刺激使ATII細(xì)胞存活率降至79.2002±3.9736％和54

5、.4843+3.3772％(P<0.05)，凋亡率由2.5150±1.1769％增至10.0525+2.8605％和32.1150±5.8331％(P<0.05)。500μMH202刺激30min，與對照組比較，ATII細(xì)胞存活率和凋亡率無明顯變化；刺激3hATII細(xì)胞存活率明顯降低(p<0.05)，凋亡率顯著升高(p<0.05)。500μMH202作用下p-ERK30min表達(dá)最強(qiáng)，此后隨著時(shí)間的延長于3h降至近對照組水平；PD980

6、59干預(yù)后與對照組比較，ATII細(xì)胞凋亡率明顯增高(op<0.05)。 結(jié)論 1．以胰蛋白酶分離，免疫粘附法純化建立ATII細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，能夠獲得滿意的細(xì)胞數(shù)量、純度和活性。 2．H202處理(ROS攻擊)可誘導(dǎo)ATII細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，ATII細(xì)胞存活率下降和凋亡率增高與氧化應(yīng)激的水平和持續(xù)時(shí)間有關(guān)。 3．ERK參與了氧化應(yīng)激狀態(tài)下ATII細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的ATII細(xì)胞可能起